Listeria monocytogenes - vermittelter Gentransfer in vitro und in vivo Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Marc Hense aus Warstein
Inhaltsverzeichnis 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.4.1 2.4.1.1 2.4.1.2 2.4.2 2.4.3 2.5 2.5.1 2.5.1.1. 2.5.1.2 2.5.2 2.5.3 2.6 2.6.1 2.6.2 2.6.3 2.6.3.1 2.6.3.2 2.6.3.3 2.6.3.4 2.6.3.5 2.7 2.7.1 2.7.2 2.7.3 2.7.3.1 2.7.3.2 '2.7.4 2.7.5 2.8 2.8.1 2.8.2 Einleitung Virale Vektoren Liposomen und andere synthetische Konjugate Nackte DNA Bakterien in der Gentherapie Listeria monocytogenes als Vektor Listerien für die somatische Gentherapie Die Gattung Listeria Das murine Listeria-Infektionsmodell Der Infektionszyklus von Listeria monocytogenes Zielsetzung der Arbeit Material und Methoden Geräte und Laborgegenstände Chemikalien Allgemein verwendete Puffer Organismen Bakterien Verwendete Escherichia coli (E. coli) Stämme Verwendete Listeria monocytogenes (X. monocytogenes) Stämme Eukaryotische Zellen Mäuse Kulturmedien Kulturmedien für Bakterien Kulturmedien für E. coli Stämme Kulturmedien für L. monocytogenes Stämme Kulturmedien für eukaryotische Zellen Antibiotika Arbeiten mit E. coli Kultivierung von E. coli Stämmen Langzeitlagerung von E. coli Stämmen Transformation von E. coli Stämmen Herstellung elektrokompetenter Zellen Elektrotransformation Herstellung CaCh-kompetenter Zellen CaCh-Transformation Nachweis von ß-Galaktosidase Arbeiten mit L. monocytogenes Kultivierung von L. monocytogenes Stämmen Langzeitlagerung von L. monocytogenes Stämmen Transformation von L. monocytogenes Stämmen Herstellung elektrokompetenter Zellen Elektrotransformation Standardisierung des Bakterienwachstums Nachweis von ß-Galaktosidase Arbeiten mit eukaryotischen Zellen Kulturbedingungen Ablösen adhärent wachsender Zellen 5 7 8 9 9 10 11 12 12 15 19 20 20 21 21 24 24
2.8.3 Zellzahlbestimmung 2.8.4 Langzeitlagerung von Zellen 2.8.5 Auftauen von Zellen 2.8.6 CaPO 4 -Transfektion 30 2.8.7 Nachweis von ß-Galaktosidase 30 2.9 Molekularbiologische Methoden 30 2.9.1 Agarosegelelektrophorese 30 2.9.2 Isolierung von Nukleinsäuren 31 2.9.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA 31 2.9.2.2 Isolierung von DNA aus Agarosegelen 31 2.9.2.3 Isolierung von chromosomaler DNA 31 2.9.2.4 Isolierung von RNA 32 2.9.3 Präzipitation von Nukleinsäuren 32 2.9.3.1 Ethanolpräzipitation 32 2.9.3.2 Ethanol/Lithiumpräzipitation 33 2.9.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 33 2.9.4.1 Photometrische Bestimmung 33 2.9.4.2 Intensitätsvergleich mit Marker-DNA 33 2.9.5 Modifikation von Nukleinsäuren 33 2.9.5.1 Restriktionsanalyse von DNA 33 2.9.5.2 Iigation von DNA 33 2.9.5.3 Modifikation von Restriktionsschnittstellen 34 2.9.5.4 Phenolextraktion 34 2.9.6 Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen 34 2.9.6.1 Southern Blotting 34 2.9.6.2 Radioaktive Markierung von Sonden 35 2.9.7 Polymerase Ketten Reaktion (PCR) 35 2.9.7.1 RT-PCR 35 2.9.7.1.1 DNAse-Behandlung von RNA 35 2.9.7.1.2 Reverse Transkription 36 2.9.7.1.3 PCR 36 2.9.7.2 Kolonie-PCR 37 2.9.7.2.1 ß-Galaktosidase PCR 37 2.9.7.2.2 CMV-Promotor PCR 37 2.9.7.3 Sequenzierung von DNA 38 2.10 Biochemische Methoden 38 2.10.1 Biosynthetische Markierung von Proteinen 38 2.10.2 Immunpräzipitation 38 2.10.3 SDS-Gelelektrophorese 39 2.11 optische Nachweismethoden 40 2.11.1 GFP-Fluoreszenz-Mikroskopie 40 2.11.2 Immunfluoreszenz-Mikroskopie 40 2.12 Immunologische Methoden 41 2.12.1 "enzyme-linked immunosorbent assay" (ELJSA) 41 2.12.2 Durchfluß-Zytometrie 42 2.12.2.1 Herstellung der Zellsuspension 42 2.12.2.2 Durchführung der Zellfärbung 42 2:12.2.3 Messung am FACScan 43 2.12.3 Zelluläre Assays 43 2.12.3.1 Radioaktive Markierung von proliferierenden Zellen 43
2.12.3.2 Gewinnung von Milzzellen 43 2.12.3.3 In vitro ReStimulierung von Milzzellen 43 2.12.3.4 Zytotoxischer T-Zellassay 44 2.12.3.5 Helfer-T-ZeUassay 44 2.13 In vitro Infektion _ 44 2.13.1 Standard-Zell-Infektionsprotokoll für L. monocytogenes 44 2.13.2 Bestimmung intrazellulärer Bakterienzahlen 45 2.14 In vivo Infektionsmodell 45 2.14.1 Haltung der Mäuse 45 2.14.2 Maus-Injektionen 45 2.14.3 Organgewinnung 45 2.14.4 Passagieren von Bakterien 46 2.14.5 Histologie 46 2.14.5.1 Fixierung von Organen 46 2.14.5.2 Gefrierschnitte 46 2.14.5.3 ß-Galaktosidase Färbung von Gefrierschnitten 46 2.14.6 Haematologie 47 2.14.7 Zytospin 47 3 Ergebnisse 48 3.1 Etablierung eines in vitro Transfektionsmodells 48 3.1.1 Konstruktion und Charakterisierung der Plasmide 48 3.1.1.1 Konstruktion des Shuttle-Plasmids perl-3cmvß und seiner Derivate 48 3.1.1.2 Konstruktion des Shuttle-Plasmids perl-3cmvgfp 49 3.1.1.3 Analyse der Shuttle-Plasmide in Eukaryoten 50 3.1.1.4 Prokaryotische Expressionsplasmide 50 3.1.1.5 Vergleich der Expression von eukaryotischen und prokaryotischen Expressionsplasmiden in Prokaryoten 50 3.1.2 Standardisierung des Bakterienwachstums 52 3.1.3 Etablierung eines in vitro Infektions-Transfektions-Systems 52 3.1.4 Intrazelluläres Wachstumsverhalten 54 3.1.5 Nachweise eukaryotischer Expression der Reporterproteine 58 3.1.5.1 Vergleichende in vitro Studien mit Reportergenexprimierenden Bakterien 58 3.1.5.2 Spleißing als Nachweis eukaryotischer Expression 60 3.1.5.3 Tetrazyklin unabhängige Expression 61 3.1.5.4 Etablierung stabiler Transfektanten 62 3.1.6 Zellspezifität der Bakterien-vermittelten Transfektion 63 3.1.7 Durchflußzytometrischer Vergleich eukaryotischer und prokaryotischer Expression von GFP 65 3.1.8 Analyse des Transfektionsvorganges 67 3.1.8.1 Versuche mit isolierter DNA 67 3.1.8.2 Analyse mit Mutanten 67 3.1.8.2.1 Versuche mit der MnlAB2 Mutante 67 3.1.8.2.2 Versuche mit L. innocua 68 3.1.8.2.3 Versuche mit der AactA2AplcB2 Mutante 69 3.1.8.2.4 Versuche mit der Ahly2 Mutante 71 3.1.8.2.5 Versuche mit der Ahly2AplcB2AplcA2 Mutante 74 3.2 Etablierung eines in vivo Transfektionsmodells 76 3.2.1 LDso-Bestimmung rekombinanter Stämme 76
3.2.2 Plasmidstabilität 80 3.2.3 Wachstumsverhalten der Bakterien in der Leber 82 3.2.4 Immunantwort des Wirtes gegen den Vektor 83 3.2.4.1 Immunantwort nach einmaliger Infektion 84 3.2.4.2 Reinfektion. 85 3.2.4.3 Antikörper-Antwort 87 3.3 In vivo Gentransfer 89 3.3.1 ß-Galaktosidase als Reportergen 90 3.3.2 GFP als Reportergen 91 3.3.2.1 Versuche mit dem Wildtyp 91 3.3.2.2 Versuche mit der L. monocytogenes Ahly2 Mutante 91 3.3.2.3 Versuche mit der L. monocytogenes AactA2AplcB2 Mutante 92 3.3.3 Depletion von Neutrophilen 93 3.3.3.1 Funktionalität des Antikörpers RB6-8C5 94 3.3.3.1.1 i. p. Infektionsmodell 94 3.3.3.1.2 i. v. Infektionsmodell 96 3.3.3.1.3 In vivo Gentransfer nach Antikörper-Depletion 99 4. Diskussion 101 4.1 In vitro Gentransfer mit L. monocytogenes 101 4.1.1 Evidenzen für erfolgreichen Transfer in vitro 101 4.1.2 Transfer-Effizienz 102 4.1.3 Mechanismus des Gentransfers 104 4.2 In vivo Gentransfer mit L. monocytogenes 105 4.2.1 In vivo Gentransfer mit verschiedenen Mutanten 106 4.2.2 Antikörper-vermittelte Neutrophilen-Depletion in vivo 106 4.3 Alternative Ansätze für ein auf L. monocytogenes basierendes Gentransfermodell 107 4.4 Zusammenfassende Beurteilung von L. monocytogenes als Vektor für die somatische Gentherapie 108 5. Zusammenfassung 110 6. Abkürzungen 111 7. Literatur 113