Einfluss von Cadmiumverbindungen auf die Struktur und die Funktion des Tumorsuppressorproteins p53

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1 Einfluss von Cadmiumverbindungen auf die Struktur und die Funktion des Tumorsuppressorproteins p53 vorgelegt von Diplom-Lebensmittelchemikerin Christina Thuy aus Speyer Von der Fakultät III - Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin (TU) zur Erlangung des akademischen Grades DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN -Dr. rer. nat.- genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dr. rer. nat. L.Kroh Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. A. Hartwig Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. M. Metzler Tag der wissenschaftlichen Aussprache: Berlin 2006 D 83

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3 Inhalt Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung Einleitung Thematische Einführung Cadmium Chemische und physikalische Eigenschaften Vorkommen und Verwendung Toxikokinetik Kanzerogenität Direkte genotoxische Effekte Indirekte genotoxische Effekte DNA-Reparatursyteme Nukleotidexzisionsreparatur Rolle von p48 in der NER von UV-induzierten DNA-Schäden Das Tumorsuppressorprotein p Eigenschaften des p53 Proteins Regulation und Modulation des p53 Proteins Struktur des p53 Proteins Auswirkungen von Mutationen in p Rolle von p53 in der NER Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle Fragestellung Material und Methoden Zellkultur Zellen Koloniebildungsfähigkeit Behandlung der Zellen I

4 Inhalt Inkubation UVC-Bestrahlung Zellzyklusmessung am Durchflusszytometer Geräteaufbau und Messprinzip Fluoreszenzfärbung Zellzyklusmessung Bestimmung des p53 Proteingehaltes Zelllyse Proteinbestimmung nach Bradford Elektrophorese und Westernblot Detektion durch Chemilumineszenz Immunpräzipitation zur Konformationsbestimmung von p Zelllyse und Vorklärung Immunopräzipitation Bestimmung der relativen Genexpression Probenvorbereitung RNA-Isolierung Photometrische Konzentrationsbestimmung RNA Gelelektrophorese cdna-synthese Quantitative Real Time PCR Prinzip Geräteaufbau Effizienzbestimmung PCR-Protokoll Schmelzkurvenanalyse Relative Quantifizierung Ergebnisse und Diskussion Messungen mit der Real Time PCR Schmelzkurvenanalyse Effizienzbestimmung UVC-Bestrahlung Koloniebildung Induktion von p II

5 Inhalt Genexpression von p21, p48 und XPC p p XPC Zellzyklusphasenverteilung Cadmium Koloniebildung Induktion von p Immunpräzipitation Genexpression von p21, p48 und XPC p p XPC Kombinationsuntersuchungen Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte Zytotoxizität Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte p53 Induktion Genexpression von p21, p48 und XPC p p XPC Zellzyklusphasenverteilung Zusammenfassende Diskussion und Ausblick Literatur A Anhang A.1 Abkürzungsverzeichnis A.2 Liste der verwendeten Chemikalien A.3 Liste der verwendeten Geräte und Verbrauchs-materialen A.4 Verwendete Lösungen und Puffer A.4.1 Zellkultur A.4.2 Präparation der Proteinextrakte, Proteinbestimmung, Elektrophorese und Westernblot III

6 Inhalt A.4.3 RNA-Isolierung und Elektrophorese A.5 Primersequenzen A.6 Darstellung eines RNA-Gels nach der RNA-Isolation A.7 Histogramme der Zellzyklusanalyse A.8 Dosis-Abstands-Kurve A.9 cdna-verdünnungreihen Publikationsliste Lebenslauf Danksagung IV

7 Zusammenfassung 1 Zusammenfassung Cadmiumverbindungen sind sowohl beim Mensch als auch im Tierversuch kanzerogen und tragen aufgrund ihrer weiten Verbreitung in der Umwelt und am Arbeitsplatz erheblich zum Krebsrisiko durch Schadstoffe bei. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nach wie vor ungeklärt, zumal ihre Mutagenität nur schwach ausgeprägt ist. Diskutiert werden u.a. die Induktion von oxidativem Stress sowie der Einfluss auf DNA-Reparaturprozesse der Zelle. Bei der Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität spielt das Tumorsuppressorprotein p53 eine große Rolle. Durch seine Funktion als Transkriptionsfaktor reguliert es die Expression einer Vielzahl von Genen, die in verschiedenen Prozessen zum Schutz der Zelle involviert sind, wie z.b. der Apoptose, der Zellzykluskontrolle und der DNA-Reparatur. Für diese Eigenschaft ist eine gefaltete Proteindomäne essenziell, die durch die Koordination von einem Zink-Ion durch drei Cystein- und einem Histidinrest stabilisiert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von löslichem CdCl 2 und partikulärem CdO auf die Struktur und damit auch auf die Funktion des Tumorsuppressorproteins p53 untersucht. Beide Verbindungen verursachten eine Umfaltung der Wildtyp-Form des Tumorsuppressorproteins p53 in die ungefaltete mutante Form. Dies hatte auch eine Hemmung von nachgeschalteten Signalwegen wie die Transkription der DNA-Reparaturgene p48 und XPC zur Folge. Um den Einfluss der Verbindungen auf die p53-stabilisierung infolge der Wirkung DNA-schädigender Agenzien zu untersuchen, wurden Untersuchungen in Kombination mit UVC-Strahlung durchgeführt. Während UVC-Strahlung zu einer Induktion der Wildtyp-Form führte, zeigten beide Cadmiumverbindungen in Kombinationsversuchen eine Hemmung der UVC-induzierten p53-stabilisierung, wenn auch bei CdCl 2 stärker ausgeprägt als bei CdO. Gleichzeitig resultierte eine Co-Inkubation in einer verstärkten Bildung der mutanten Konformation. Im Einklang damit zeigten beide Verbindungen eine Hemmung der UVC-induzierten Genexpression der Zielgene p48 und XPC. Da diese Proteine eine große Rolle bei der Reparatur von sperrigen DNA-Addukten, wie sie z.b. durch UV-Strahlung oder polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) entstehen, spielen, könnte eine Beeinträchtigung der Expression in einer Beeinflussung von DNA-Reparaturprozessen resultieren. 1

8 Zusammenfassung Um zu untersuchen, ob Cadmiumverbindungen auch andere Kontrollmechanismen stören, wurde der Einfluss auf die Zellzykluskontrolle in Kombination mit UVC-Strahlung untersucht. Während UVC-Strahlung 10 Stunden nach der Bestrahlung mit 5 J/m 2 zu einem S-Phasenarrest führte, zeigte eine Vorinkubation mit den jeweiligen Cadmiumverbindungen und anschließender Bestrahlung eine Zellzyklusphasenverteilung, die nahezu der von unbestrahlten Zellen entspricht. Dagegen resultierte eine alleinige Behandlung mit den jeweiligen Cadmiumverbindungen in einem leichten G1-Phasenarrest. Die Genexpression von p21, einem Protein, dem sowohl im G1-Phasenarrest als auch im S-Phasenarrest eine Rolle zugesprochen wird, wurde sowohl durch die jeweiligen Cadmiumverbindungen als auch durch UVC-Strahlung erhöht, während die UVC-induzierte p21-expression infolge einer Co- Inkubation mit Cadmium und UVC-Strahlung inhibiert wurde. Da p53 als Transkriptionsfaktor eine Vielzahl von Genen reguliert, die in verschiedenen Prozessen zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität eine Rolle spielen, könnte eine Beeinflussung seiner Struktur und damit auch seiner Funktion einen Mechanismus darstellen, der zur krebserzeugenden Wirkung von Cadmiumverbindungen beiträgt 2

9 Einleitung 2 Einleitung 2.1 Thematische Einführung Die kanzerogene Eigenschaft von Cadmiumverbindungen ist bekannt, dennoch sind die zu Grunde liegenden Mechanismen noch weitestgehend unklar, zumal das mutagene Potenzial nur schwach ausgeprägt ist. Vor allem in der Metallindustrie sind Arbeiter chronisch gegenüber hohen Dosen partikulärer und löslicher Cadmiumverbindungen exponiert. Allerdings haben Cadmiumverbindungen aufgrund ihrer Persistenz in biologischen Systemen, sowie ihrer Akkumulation in verschiedenen Geweben des Menschen auch für beruflich nicht exponierte Personen eine große Bedeutung. Für das in der vorliegenden Arbeit untersuchte Metall Cadmium konnte in früheren Studien gezeigt werden, dass es die genotoxische Wirkung von DNA-schädigenden Agenzien erhöht. So verstärkt Cadmium(II) die durch B[a]P (Benzo[a]pyren) verursachte Zelltransformation syrischer Hamsterembryonalzellen (Rivedal und Sanner, 1981) und erhöht in V79 Zellen die durch UVC-Strahlung induzierte Mutationsrate (Hartwig und Beyersmann, 1989). Es scheinen sich also vielmehr indirekte genotoxische Eigenschaften hinter dem kanzerogenen Potenzial zu verbergen als eine direkte DNA-Schädigung, in dem es z.b. in zelluläre Reparaturmechanismen eingreift (Hartwig et al., 1998). Zellen unterliegen einer permanenten Schädigung durch endogene und exogene Einwirkungen. Zur Beseitigung von auftretenden DNA-Schäden, bevor sie durch unkorrekte Replikation und als Folge davon zur Manifestierung von Mutationen führen, hat die Zelle verschiedene Mechanismen entwickelt. Die wichtigsten Reparaturprozesse sind die NER (Nukleotidexzisionsreparatur), die BER (Basenexzisionsreparatur) und die MMR (Mismatchreparatur). Die NER beseitigt helixverzerrende DNA-Addukte, die z.b. durch UV- Strahlung oder polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) gebildet werden, während über die BER Basenmodifikationen wie sie z.b. durch reaktive Sauerstoffspezies entstehen, repariert werden. Die MMR beseitigt Basenfehlpaarungen, die als Folge von Replikationsfehlern auftreten. Eine Reparatur der DNA-Schäden ist häufig mit einer Arretierung des Zellzyklus verbunden, um die notwenige Zeit zur Reparatur der Schäden zu gewährleisten. Ist das Ausmaß der Schädigung zu groß, wird der programmierte Zelltod, die 3

10 Einleitung Apoptose, eingeleitet. Ein zentrales Protein, welches diese drei Mechanismen koordiniert, ist das Tumorsuppressorprotein p53. Das Protein p53 besitzt ein Zink-bindendes Proteinmotiv, in dem ein Zink-Ion von drei Cysteinresten und einem Histidinrest koordiniert wird. Ergebnisse der letzten Jahre haben gezeigt, dass Zinkfingerstrukturen empfindliche Angriffspunkte für toxische Metallverbindungen sind. Die Sequenzierung des menschlichen Genoms hat inzwischen ergeben, dass ca. 3 % aller Gene für Proteine mit Zinkfingerstrukturen kodieren (Maret, 2003). Das Tumorsuppressorprotein p53 wird zwar nicht zu den Zinkfingerproteinen gezählt, da es keine fingerähnliche Struktur ausbildet (Hainaut und Mann, 2001), könnte aber dennoch durch Wechselwirkung von Metall-Ionen mit der Zink-bindenden Domäne in seiner Funktion beeinträchtigt werden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind Untersuchungen zum Einfluss sowohl partikulärer als auch löslicher Cadmiumverbindungen auf die Struktur und die damit verbundene Funktion des Tumorsuppressorproteins p53. Damit soll ein möglicher Einfluss auf DNA- Reparaturprozesse sowie auf die Zellzykluskontrolle aufgeklärt werden. 2.2 Cadmium Chemische und physikalische Eigenschaften Das Element Cadmium ist ein Metall der 2. Nebengruppe des Periodensystems mit einem Atomgewicht von 112,41 und der Ordnungszahl 48. Es sind acht natürlich vorkommende Isoptope bekannt ( 114 Cd, 112 Cd, 111 Cd, 110 Cd, 113 Cd, 116 Cd, 106 Cd und 108 Cd). Es handelt sich um ein silberweißes, glänzendes, sehr weiches und plastisch verformbares Metall. In seinen Verbindungen hat es die Oxidationsstufe +2. Lösliche Verbindungen sind z.b. Cadmiumchlorid, Cadmiumsulfat und Cadmiumacetat, wasserunlösliche z.b. Cadmiumsulfid, Cadmiumcarbonat und Cadmiumoxid (Riedel, 1999) Vorkommen und Verwendung Cadmium wurde 1817 von F. Strohmeyer als Metall in Zinkcarbonat entdeckt (griech.: cadmeia = Zinkerz (Galmei)). In der Erdrinde ist das Metall nur in sehr geringen Mengen vertreten. Reine Cadmiumminerale sind der Greenockit (hexagonales CdS), Hawleyit (kubisches CdS), Ovatit (CdCO 3 ), Monteponit (CdO) und der Cadmoselit (CdSe). Cadmium 4

11 Einleitung ist in Zinkmineralen wie der Zinkblende zu 0,1 bis 0,5 % und im Zinkspat bis zu 5 % enthalten (Riedel, 1999). Das Metall gelangt über Emission aus Industrieanlagen, vor allem Zinkhütten, Eisen- und Stahlwerken, Müllverbrennungsanlagen und Braunkohlekraftwerken sowie durch Verbrennung fossiler Brennstoffe und Einsatz von Phosphatdüngemitteln in der Landwirtschaft in die Umwelt. Industriell wird Cadmium zur Herstellung von Nickel- Cadmium-Batterien eingesetzt. Des Weiteren findet es für Korrosionsschutzüberzüge von Metallen sowie als Stabilisator in der Kunststoffindustrie Verwendung (zusammengefasst in Stöppler, 1991; Pinot et al., 2000) Toxikokinetik Cadmium ist ein toxisches, biologisch nicht essenzielles Schwermetall. Für einen beruflich nicht exponierten Menschen ist die Hauptaufnahmequelle die Nahrung, hier vorwiegend pflanzliche Lebensmittel und Innereien, einen geringen Anteil liefert das Trinkwasser (10 %). Die durchschnittliche tägliche Aufnahme über Nahrung und Trinkwasser beträgt zwischen 10 und 30 µg, während die inhalative Aufnahme mit 0,02 µg bei Gehalten der Außenluft von 1 bis 5 ng/m 3 nur unwesentlich zur Gesamtbelastung beiträgt. Einen großen Beitrag zur täglichen Cadmiumaufnahme leistet allerdings Tabak, so dass Raucher erhöhte Cadmiumgehalte im Körper aufweisen. Eine Zigarette enthält etwa 1-2 µg Cadmium. Davon werden etwa 10 % inhaliert und hiervon wiederum 50 % resorbiert, so dass das Rauchen von einer Schachtel Zigaretten pro Tag in einer zusätzlichen Aufnahme von etwa 1-2 µg resultiert. Somit ist der Eintrag höher als über die Nahrung, da aus dem Gastrointestinaltrakt nur etwa 5 % des aufgenommenen Cadmiums resorbiert werden. Nach Aufnahme in den Körper akkumuliert es an Metallothionein gebunden, vor allem in der Niere und der Leber und weist Halbwertszeiten von bis zu 30 Jahren auf. Die totale Körperbelastung eines beruflich nicht exponierten 50 Jahre alten Menschen beträgt etwa 15 mg (Oberdörster, 1989; Stöppler, 1991). Die einzelnen Beiträge der Organe sind in Tabelle 1 aufgelistet. 5

12 Einleitung Tabelle 1: Cadmiumgehalte im Körper (zusammengefasst in IARC, 1993, 1997). Gewebe bzw. Körperflüssigkeiten Niere Leber Lunge Urin Blut Gehalt mg/kg Nassgewicht 1-3 mg/kg Nassgewicht ca. 1,3 mg/kg Trockengewicht 0,4-4 µg/l 0,2-4 µg/l Kanzerogenität Cadmium wurde von der IARC (International Agency for Research on Cancer) als kanzerogen für den Menschen eingestuft (IARC, 1993, 1997). Epidemiologische Studien zeigen eine deutliche Korrelation zwischen Cadmiumexposition und einem erhöhten Auftreten von Tumoren vor allem der Lunge, aber auch der Prostata, der Niere und des Magens. Auch im Versuchstier zeigt sich die kanzerogene Wirkung aller untersuchten Cadmiumverbindungen (CdCl 2, CdSO 4, CdS, CdO). Das kanzerogene Potenzial kann allerdings nur teilweise durch seine direkte genotoxische Eigenschaft erklärt werden, da es sich als nicht mutagen in bakteriellen Testsystemen und als nur schwach mutagen in verhältnismäßig hohen Konzentrationen in Säugerzellen erwiesen hat (Hartwig et al., 1998) Direkte genotoxische Effekte Cadmium induziert Chromosomenabberationen (Ochi und Ohsawa, 1985) und DNA- Strangbrüche (Ochi und Ohsawa, 1983; Snyder, 1988; Dally und Hartwig, 1997) in kultivierten Zellen. Als ein möglicher Mechanismus für die genotoxische Wirkung wird die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) aufgrund einer Störung der zellulären Verteidigungsmechanismen diskutiert. Eine vermehrte Bildung von ROS wurde in verschiedenen Zelllinien gezeigt (Yang et al., 1997; Szuster-Ciesielska et al., 2000; Filipic und Hei, 2004). Ochi et al. (1987) untersuchten in V79-Zellen den Einfluss von CdCl 2 auf die Aktivität von Enzymen, die an der Metabolisierung von ROS direkt oder indirekt beteiligt sind, wie z.b. Superoxiddismutase, Katalase, GSH-Peroxidase und GSSG-Reduktase (Glutathiondisulfid-Reduktase). Die Funktionsweise dieser Enzyme ist in Abbildung 1 dargestellt. Es konnte allerdings keine Beeinflussung der untersuchten Enzymaktivitäten 6

13 Einleitung festgestellt werden, wohingegen der Gehalt an GSH signifikant abnahm. Als Gründe dafür wurden verschiedene Punkte diskutiert. Einerseits könnte Cadmium in die Synthese des GSH eingreifen, indem wichtige Enzyme für dessen Synthese (γ-glutamyl-cystein-synthase, Glutathionsynthase) beeinflusst werden. Andererseits könnte durch Induktion von Cysteinreichem Metallothionein, welches durch Schwermetalle wie Cadmium induziert wird, die Verfügbarkeit von Cystein in der Zelle deutlich gesenkt werden, wodurch weniger GSH synthetisiert werden kann. Einen Zusammenhang zwischen GSH-Gehalt und Cadmiumzytotoxizität zeigten auch die Ergebnisse von Kang et al. (1989) sowie von Kang und Enger (1990), bei denen von einer Korrelation zwischen wachstumsbedingtem GSH- Gehalt bzw. GSH-Depletion durch Hemmung der γ-glutamyl-cystein-synthase mittels Buthionin Sulfoximin (BSO) und Cadmiumzytotoxizität berichtet wurde. Des Weiteren zeigte eine Studie an einer cadmiumresistenten A549 Subpopulation, dass die im Gegensatz zur sensitiven A549 Subpopulation erhöhte Resistenz auf einen etwa 2-fach höheren GSH-Gehalt zurückzuführen ist (Hatcher et al., 1995). Abbildung 1: Metabolismus von ROS (Marquardt und Schäfer, 1997) Indirekte genotoxische Effekte Größere Relevanz wird allerdings den indirekten genotoxischen Effekten zugeschrieben, da Cadmium die Mutagenität von anderen DNA-schädigenden Agenzien verstärkt. So beobachteten Rivedal und Sanner (1981) eine Komutagenität von Cadmium(II) mit B[a]P in syrischen Hamsterembryonalzellen und Hartwig und Beyersmann (1989) berichteten von einer Erhöhung der, durch UVC-Strahlung induzierten Mutationsrate in V79 Zellen. Nocentini (1987) zeigte bereits sehr früh eine Beeinflussung der DNA-Replikation und Reparatur UV-geschädigter DNA in menschlichen Zellen. Snyder et al. (1989) sowie Hartmann und Hartwig (1998) zeigten eine Hemmung der Schadenserkennung nach UV- 7

14 Einleitung Bestrahlung in HeLa S3 Zellen. Dieser Befund sowie die Ergebnisse von Fatur et al. (2003) die eine Hemmung der Exzision UV-induzierter CPDs in chinesischen Hamsterzellen zeigten, weisen darauf hin, dass die komutagene Wirkung von Cadmium auf eine Störung zellulärer Reparaturmechanismen zurückzuführen ist Auf molekularer Ebene zeigten Asmuss et al. (2000), dass bei Verwendung von gereinigtem XPA, einem Protein, das an der NER beteiligt ist, dessen Bindung an ein UVC-geschädigtes Oligonukleotid durch CdCl 2 vollständig gehemmt wird. Dieser Effekt wird durch eine equimolare Konzentration an Zink aufgehoben, was auf eine Verdrängung von Zink in der DNA-bindenden Zinkfingerdomäne des XPA-Proteins schließen lässt. Untersuchungen an einem synthetisierten Peptid, das die Zinkfingerstruktur des humanen XPA-Proteins repräsentiert, konnten eine quantitative Substitution von Zn(II) durch Cd(II) zeigen. Darüber hinaus erwiesen sich die Cadmium-gebundenen Thiole durch die hohe Bindungskonstante von Cd(II) als oxidationsunempfindlich gegen H 2 O 2 (Kopera et al., 2004). Eine Hemmung der Reparatur von DNA-Schäden hat zur Folge, dass die Schäden infolge stattfindender DNA-Replikation zu Mutationen führen können. Besonders kritisch sind Mutationen in Onkogenen, die zu einem unkontrollierten Wachstum der Zelle führen können, sowie Mutationen in Tumorsuppressorgenen, deren Genprodukte u.a. an der Zellzykluskontrolle beteiligt sind. 2.3 DNA-Reparatursyteme Die DNA unterliegt einer permanenten Schädigung sowohl durch endogene Stoffwechselprozesse und durch exogene Quellen wie UV-Strahlung, ionisierende Strahlung als auch durch eine Reihe von chemischen Kanzerogenen. Das entstehende Schadensspektrum reicht von oxidativen Basenschäden bis zu DNA-Einzel- und DNA-Doppelstrangbrüchen, DNA-Alkylierungsschäden und DNA-Addukten. Um die Integrität des Genoms zu gewährleisten, hat die Zelle verschiedene DNA- Reparaturmechanismen entwickelt, bevor die Schäden infolge einer fehlerhaften Replikation zu Mutationen führen können. Die so genannte MMR (Mismatchreparatur) ist für die Reparatur von Basenfehlpaarungen, wie sie durch Replikationsfehler entstehen, verantwortlich. Für oxidative Basenmodifikationen, die durch reaktive Sauerstoffspezies gebildet werden, ist die BER (Basenexzisionsreparatur) spezifisch. Für Umweltmutagene ist das bedeutendste Reparatursystem die NER (Nukleotidexzisionsreparatur). Sie erkennt und 8

15 Einleitung repariert großräumige DNA-Addukte, die zu einer Verzerrung der Helixstruktur der DNA führen. Hierzu zählen z.b. UV-induzierte Schäden, sowie Benzo[a]pyren- und Aflatoxininduzierte DNA-Addukte Nukleotidexzisionsreparatur Da in der vorliegenden Arbeit als DNA-schädigendes Agens UVC-Strahlung eingesetzt wurde, wird im Folgenden näher auf den Mechanismus der NER eingegangen. Es kann grundsätzlich zwischen sechs Schritten unterschieden werden: Schadenserkennung Entwindung der Doppelhelix am DNA-Schaden Einzelstrang-Inzision an beiden Seiten des Schadens Exzision des Schadens in Form eines 24 bis 30 Nukleotide langen Oligonukleotids DNA-Neusynthese des zuvor ausgeschnittenen Oligonukleotids Ligation Für die NER ist ein koordiniertes Zusammenwirken von mindestens 30 verschiedenen Proteinen erforderlich. Mutationen in NER-Genen verursachen die seltene Erbkrankheit Xeroderma pigmentosum, bei der die Patienten extrem lichtempfindlich und anfällig für die Entstehung von Hautkrebs sind. Es existieren acht Komplementationsgruppen (XPA bis XPG und XPV), die auf jeweils verschiedene Gendefekte von an der NER beteiligten Proteinen zurückzuführen sind und letztendlich in allen Fällen (mit Ausnahme von XPV) zu einer Beeinträchtigung der Inzision führen. Je nachdem in welchem Bereich der DNA sich der Schaden ereignet, kann die NER in zwei Untergruppen eingeteilt werden. Schäden, die sich im transkribierten Strang aktiv transkribierter Gene ereignen, werden über die TCR (transkriptionsgekoppelte Reparatur) repariert, während Schäden im restlichen Genom über die GGR (globale genomische Reparatur) beseitigt werden. Diese beiden Prozesse unterscheiden sich nur im ersten Schritt der NER. Nach der Schadenserkennung verlaufen die beiden Wege analog. In der TCR scheint die RNA Polymerase II das eigentliche Schadenserkennnungssignal für die Rekrutierung der NER-Proteine darzustellen. Nach erfolgter Schadenserkennung kommt es in Folge einer Konformationsänderung der DNA zur Anlagerung von NER-Proteinen. In der GGR ist ein Protein-Komplex bestehend aus XPC und hhr23b für die Schadenserkennung 9

16 Einleitung zuständig. Volker et al. (2001) konnten durch die Anwendung einer lokalen UV-Bestrahlung und dem Einsatz von fluoreszenzmarkierten Antikörpern die Reihenfolge der Anlagerung der NER-Proteine zeigen (Abbildung 2). Nach Anlagerung des XPC-Genproduktes im Komplex mit hhr23b bindet der Transkriptionsfaktor TFIIH. Dieser besteht aus mehreren Untereinheiten und beinhaltet als größte Untereinheiten die beiden Helikasen XPB und XPD (Egly, 2001). Im Anschluss an die lokale Entwindung der DNA kommt es zur Anlagerung der 3 -Nuklease XPG, von XPA, RPA und letztendlich zur Rekrutierung des 5 -Nuklease- Komplexes bestehend aus ERCC1 und XPF. Während die Anlagerung der Helikase XPG unabhängig von XPA erfolgt, kann der Komplex aus ERCC1 und XPF erst nach erfolgter Bindung des XPA erfolgen. Dennoch ist die Aktivität des Enzyms XPG abhängig von XPA. TFIIH XPC-hHR23B XPA-RPA XPG ERCC1-XPF Abbildung 2: Modell für den Aufbau des menschlichen NER-Exzisions-Komplexes. (Volker et al., 2001). Nach erfolgter Exzision des Schadens in Form eines 24 bis 30 Nukleotide langen Oligonukleotids wird die entstandene Lücke durch eine DNA-Neusynthese durch die Polymerasen δ und ε mit Hilfe von PCNA, RPA und RFC aufgefüllt. Die Ligation durch die Ligase I schließt letztendlich den Reparaturprozess ab (zusammengefasst in Friedberg, 2001). 10

17 Einleitung Rolle von p48 in der NER von UV-induzierten DNA-Schäden UV-Strahlung kann in drei Wellenlängenbereiche eingeteilt werden. UVA umfasst die Wellenlängen von 400 bis 320 nm, UVB die von 320 bis 290 nm und UVC schließt den Bereich zwischen 290 und 100 nm ein. Als umweltrelevante, DNA-schädigende UV- Strahlung spielen nur UVA und UVB eine Rolle, da Wellenlängen kleiner 320 nm fast vollständig von der Ozonschicht absorbiert werden. Dabei handelt es sich bei den durch UVA-Strahlung induzierten Schäden hautsächlich um oxidative Basenschäden, während UVB-Strahlung, analog zu UVC-Strahlung, DNA-Photoprodukte induziert. Da allerdings das Absorptionsmaximum der Basen innerhalb der DNA bei 260 nm liegt und somit durch Bestrahlung mit UVC eine effiziente photochemische Reaktion stattfindet, wird in den meisten Studien UVC-Strahlung angewendet. UVB- und UVC-Strahlung führen hauptsächlich durch eine [2+2]-Cycloaddition benachbarter Pyrimidine zur Bildung von zwei Produkten, zum einen von Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren (CPD), die mit ca. 75 % den Hauptteil der Photoprodukte einnehmen und zum anderen von (6-4)-Photoprodukten (Abbildung 3) (van Steeg und Kraemer, 1999). UVC- Strahlung Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer (6-4)-Photoprodukt Abbildung 3: Entstehung von DNA-Schäden nach UVC-Bestrahlung. 11

18 Einleitung Nach heutigem Kenntnisstand wird zusätzlich zum XPC einem weiteren Protein, dem DDB- Komplex bestehend aus dem XPE-Genprodukt p48 (DDB2) und p127 (DDB1) eine Rolle im ersten Schritt der Schadenserkennung zugeschrieben. Dieser Komplex scheint vor allem bei der Schadenserkennung von CPDs von Bedeutung zu sein, indem er die Anlagerung von XPC an CPDs vermittelt (Fitch et al., 2003b; Wang et al., 2004). XPC erkennt eine spezifische DNA-Struktur, die aufgrund einer Störung der Basenpaarung infolge des DNA-Adduktes einzelsträngige Bereiche innerhalb der DNA-Doppelhelix beinhaltet. (6-4)-Photoprodukte führen zu einer stärkeren Helixverzerrung als CPDs und können somit vermutlich direkt durch XPC erkannt werden. CPDs werden nicht komplett von XPC erkannt und benötigen zunächst die Bindung des DDB-Komplexes (Sugasawa et al., 2002). Ein weiterer Grund für die unterschiedliche Schadenserkennung der beiden Photoprodukte besteht in der Tatsache, dass sich (6-4)-Photoprodukte weniger häufig in Nukleosomen gebundener DNA ereignen als CPDs (Fitch et al., 2003a; Thoma, 1999). Für die Reparatur im Kontext mit Chromatin ist zunächst ein DNA-Remodeling von Nöten, um die Zugänglichkeit der DNA für die NER- Proteine zu gewährleisten. Hwang et al. (1998) erkannten ein Tryptophan-Asparaginsäure- Motiv (WD-Motiv) im p48 Protein, das eine Ähnlichkeit zu den WD-Motiven in Proteinen besitzt, die in der Re-Organisation von Chromatin involviert sind. So z.b. in einer Untereinheit des chromatin assembly factors CAF-1, dessen Bezug zur Reparatur von UVinduzierten Schäden bereits von Gaillard et al. (1996) gezeigt wurde. Des Weiteren konnte eine Interaktion zwischen DDB und der CBP/p300 Histon-Acetyl-Transferase gezeigt werden, die als Folge einer Acetylierung von Histonen zur Relaxation des Chromatins führt (Datta et al., 2001; Moser et al., 2005; Rapic-Otrin et al., 2002). Im Anschluss an die Anlagerung des DDB-Komplexes an die DNA kommt es zu einer Ubiquitinierung von DDB2. Dies hat den proteasomalen Abbau von DDB2 zur Folge, wodurch dann XPC an das DNA- Addukt binden kann (Chen et al., 2001; Matsuda et al., 2005; Rapic-Otrin et al., 2002; Sugasawa et al., 2005). hhr23 XPC Ubiquitin DDB2 hhr23 XPC 6-4PP DDB2 CPD DDB1 Abbildung 4: Model für die Schadenserkennung von UV-induzierten Photoprodukten (Adimoolam und Ford, 2003; Ford, 2005). 12

19 Einleitung 2.4 Das Tumorsuppressorprotein p Eigenschaften des p53 Proteins Bei der Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität hat das Tumorsuppressorprotein p53 eine große Bedeutung. Seine tumorsuppressive Eigenschaft zeigt sich schon allein durch die Tatsache, dass das Gen, welches für p53 kodiert, in ca. 50 % aller menschlichen Tumoren mutiert ist. Die meisten Mutationen ereignen sich in Bereichen des Gens, die für die DNA- Bindungsdomäne des Proteins kodieren. Dabei handelt es sich oftmals um Punktmutationen (Martin et al., 2002). p53 ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 53 kda. Seine Sequenz lässt sich in eine N-terminale Transaktivierungsdomäne, eine DNA- Bindungsdomäne und eine C-terminale regulatorische Region einteilen. Die C-terminale Domäne beinhaltet drei funktionelle Motive, zum einen drei Kernlokalisierungssignale und ein Kernexportsignale, die die subzelluläre Lokalisation regulieren sowie eine Oligomerisierungsdomäne (Abbildung 5) (Stewart und Pietenpol, 2001; Michael und Oren, 2003). Abbildung 5: verschiedene Domänen des p53 Proteins (Michael und Oren, 2003). NLS: Kernlokalisierungssignal; NES: Kernexportsignal. Die Eigenschaft, als Tumorsuppressorprotein zu fungieren, lässt sich auf seine Funktion als Transkriptionsfaktor zurückführen. Wie Cho et al. (1994) sowie Clore et al. (1994) zeigten, bindet p53 in seiner aktiven Form als Tetramer bestehend aus vier identischen Untereinheiten an DNA, die vier Wiederholungen der Pentamersequenz 5 -Pu-Pu-Pu-C-A/T-3 enthält und steuert so die Expression einer Vielzahl von Genen. Reguliert werden u.a. Gene, die in die Zellzykluskontrolle, in die Apoptose aber auch direkt in die DNA-Reparatur involviert sind. 13

20 Einleitung Regulation und Modulation des p53 Proteins In normalen ungestressten Zellen unterliegt das Protein einem ständigen Ubiquitinvermittelten mdm2 abhängigen Abbau und wird somit auf einem niedrigen Level in der Zelle gehalten (Halbwertszeit von 15 bis 20 Minuten). Das Protein mdm2 bindet hierzu an die Transaktivierungsdomäne im N-teminalen Bereich des p53 Proteins (siehe Abbildung 5) und überträgt dann als E3-Ligase Ubiquitinreste auf p53, wodurch der Abbau durch das 26S- Proteasom eingeleitet wird (Abbildung 6). A B Abbildung 6: Ubiquitin-vermittelter Proteinabbau (Ciechanover, 1998). (A) Konjugation von Ubiquitin an das zu degradierende Protein. (B) Abbau des Proteins durch das 26S-Proteasom. (1) Aktivierung von Ubiquitin durch E1. (2) Transfer des aktivierten Ubiquitins von E1 auf ein Mitglied der E2-Familie. (3) Transfer des aktivierten Ubiquitins von E2 auf eine substratspezifische E3-Ligase. (4) Ausbildung einer mit dem Substrat kovalent verknüpften Polyubiquitin-Seitenkette. (5) Bindung des polyubiquitinierten Substrats an den Ubiquitin-Rezeptor in der 19S-Unterheinheit des 26S-Proteasoms und proteolytische Spaltung des Substrats zu kurzen Peptiden durch die 20S-Untereinheit. (6) Recycling von Ubiquitin durch Isopeptidasen. 14

21 Einleitung Infolge von DNA-Schäden kommt es zu verschiedenen Modifikationen, wie Acetylierung und Phosphorylierung am Protein. Phosphorylierungen haben zur Folge, dass die Bindung von mdm2 verhindert wird und somit kein Abbau des Proteins mehr stattfinden kann. Dies führt somit zu seiner Stabilisierung und Erhöhung der Halbwertszeit. Acetylierungen erhöhen die Sequenz-spezifische DNA-Bindung an so genannte p53 responsive Elemente in der Promotorregion bzw. in intronischen Segmenten seiner Zielgene und führen somit zu deren Transkription (zusammengefasst in Hainaut und Hollstein, 2000; Stewart und Pietenpol, 2001) Struktur des p53 Proteins Die Bindung von p53 an spezifische DNA Sequenzen wird durch seine konformationsspezifische Struktur in der zentralen Bindungsdomäne (Aminosäuren ) vermittelt. Die Struktur besitzt ein Sandwich von 2 ß-Faltblättern, bestehend aus 4 bzw. 5 ß- Strängen, des Weiteren ein Loop-β-Faltbatt-Helix-Motiv, das mit der großen Furche der DNA interagiert sowie ein Loop-Helix-Motiv (L2/L3), das mit der kleinen Furche der DNA interagiert. Das Motiv L2/L3 wird durch die Koordinierung eines Zink-Ions mittels dreier Cysteine (Cys176, Cys238, Cys242) und eines Histidins (His179) stabilisiert (Abbildung 7 und Abbildung 8). Im Gegensatz zu so genannten Zinkfingerproteinen, in denen sich durch die Koordination eines Zink-Ions eine fingerähnliche Struktur ausbildet, die sich in die große Furche der DNA einlagert, ist im p53 die Zink-bindende Domäne nicht direkt an der DNA-Bindung beteiligt. Der Hauptkontakt zwischen DNA und p53 wird stattdessen über Arg248 innerhalb des L3- Loop vermittelt und erfolgt über die kleine Furche der DNA. Das Vorhandensein des Zink- Ions ist aber dennoch essenziell für seine Struktur und Funktion als Transkriptionsfaktor. Eine Behandlung mit Metallchelatoren führt zu einer Herauslösung des Zink-Ions aus der Struktur, wodurch es durch Auffaltung des Proteins zum Verlust der Tertiärstruktur und damit auch zu einem Verlust der DNA-Bindungsfähigkeit kommt (Hainaut und Milner, 1993b; Verhaegh et al., 1998; Meplan et al., 2000). Ebenso führte eine Oxidation der Cysteine mittels Diamid zu einer Konformationsänderung und damit zu einer Hemmung der DNA-Bindung (Hainaut und Milner, 1993a). Darüber hinaus resultierte eine Substitution der Zink-bindenden Cysteine gegen Lysin in einer verminderten DNA-Bindung von p53 (Rainwater et al., 1995). 15

22 Einleitung Abbildung 7: Topologisches Diagramm der Sekundärstruktur von p53 (Cho et al., 1994). Zink-Ion Abbildung 8: DNA-Bindungsdomäne von p53 (modifiziert nach Wang et al., 2001). 16

23 Einleitung Auswirkungen von Mutationen in p53 Als Folge von Mutationen im Gen, das für das p53 Protein codiert, kann es zu einem Funktionsverlust als Tumorsuppressorprotein kommen. Die meisten Mutationen führen zu einer Beeinträchtigung der sequenzspezifischen Transaktivierungs-Aktivität, wodurch die Expression von Genen, die z.b. in der Zellzykluskontrolle und der Apoptose involviert sind, beeinträchtigt wird. Dennoch zeigten verschiedene Studien, dass bestimmte Arten von Mutationen, so genannte gain-of-function-mutante zu einem Funktionsgewinn des Proteins führen, die dem Protein eine onkogene Eigenschaft verleihen. Eine der zusätzlichen Funktionen ist die Hochregulierung von Genen, die für die Steuerung der Zellproliferation zuständig sind (z.b. c-myc, c-fos, PCNA, EGFR). Ein weiterer Mechanismus, durch den Mutationen in p53 heterozygoten Zellen zur Tumorprogression beitragen könnten, ist die dominant-negative Inhibierung der Wildtyp-Form durch mutantes p53. Die infolge einer Aktivierung von wildtyp p53 erfolgten Tetramerisierung und somit die sequenzspezifische DNA-Bindung kann durch die Bildung von Hetero-Oligomeren aus Wildtyp- und mutanter Form inhibiert werden (Chan et al., 2004; Sigal und Rotter, 2000; van Oijen und Slootweg, 2000) Rolle von p53 in der NER Erste Hinweise darauf, dass p53 eine Rolle in der NER spielt, kommen von Beobachtungen von Wang et al. (1995) die zeigten, dass p53 mit den Helikasen XPB und XPD wechselwirkt. Allerdings zeigen in vitro Versuche keine Notwendigkeit von p53 für den Ablauf der NER, so dass p53 eine Rolle in der NER im Kontext mit Chromatin zu spielen scheint. Des Weiteren zeigten Versuche an Hautfibroblasten, die homozygote Mutationen des p53-gens tragen, dass p53 für die globale genomische Reparatur von UV-induzierten CPDs benötigt wird, während die transkriptionsgekoppelte Reparatur unbeeinflusst ist (Ford und Hanawalt, 1995). Die Reparatur wurde mit Hilfe der T4-Endonuklease, die spezifisch CPDs erkennt, gemessen. Ford und Hanawalt (1997) konnten mittels eines Immunoassays mit spezifischen Antikörpern gegen CPDs und auch gegen (6-4)-Photoprodukte zeigen, dass der Effekt von p53 auf die Reparatur von (6-4)-Photoprodukte, die sich im Gegensatz zu CPDs weniger häufig in Nukleosomen gebundener DNA ereignen, geringer ist als auf CPDs. Hwang et al. (1999) sowie Adimoolam und Ford (2002) konnten zeigen, dass p53 als Transkriptionsfaktor die 17

24 Einleitung NER-Proteine p48 und XPC induziert und somit eine indirekte Rolle in der NER einnimmt. Für eine Anlagerung des Schadenserkennungsprotein XPC an CPDs ist p53 essenziell. Dies ist vermutlich auf die Induktion von p48 infolge von DNA-Schäden zurückzuführen (Wang et al., 2003). Die Beteiligung von p48 in der NER und seine Rolle beim DNA-Remodeling wurde schon in Kapitel vorgestellt. Allerdings zeigen Arbeiten von Rubbi und Milner (2003), dass XPE-Zellen eine normale UV-induzierte Chromatin-Relaxation aufweisen, so dass die p53 vermittelte Relaxation unabhängig von p48 ist. Ebenso wie p48 ist auch p53 in der Lage, die Histon-Acetyltransferase p300 an Chromatin zu rekrutieren und so eine Histon Acetylierung auszulösen. Es scheint von Bedeutung zu sein, zwischen Chromatin-Relaxation, für die p48 entbehrlich ist und Chromatin-Remodeling, das durch p48 eingeleitet wird, zu unterscheiden (Allison und Milner, 2004). p53 p53re DDB2 p53 p53 p53re XPC Abbildung 9: Auslösung der Transkription von DDB2 und XPC durch Bindung von p53 an p53 responsive Elemente (p53re) (modifiziert nach Adimoolam und Ford, 2003). 18

25 Einleitung Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle Eine Zelle durchläuft von einer Teilung bis zur nächsten vier Phasen im Zellzyklus (Abbildung 10). Abbildung 10: Übersicht über die einzelnen Phasen des Zellzyklus (Eisenbrand und Metzler, 1994). Nach der Zellteilung (M-Phase) geht die Zelle in die so genannte G1-Phase über. Hier wird die Zellmasse verdoppelt und Nukleotide für die nächste Phase, die S-Phase (Synthesephase) synthetisiert. In der S-Phase wird die DNA repliziert bis dann nach einer zweiten Ruhephase (G2-Phase) die Zellteilung stattfindet und so an deren Ende zwei identische Zellen vorliegen. In einer typischen, sich teilenden eukaryotischen Zelle verbleibt die Zelle etwa 12 Stunden in der G1-Phase, sechs bis acht Stunden in der S-Phase, bis sie dann nach einer Ruhephase (G2- Phase) von ca. drei bis sechs Stunden in die etwa 30 Minuten anhaltende Mitose übergeht. Die exakte Länge der einzelnen Phasen variiert allerdings zwischen Zelltyp und Wachstumsbedingungen (Shackelford et al., 1999). Um zu gewährleisten, dass sich auftretende DNA-Schäden durch fehlerhafte Replikation nicht in Mutationen manifestieren, besitzt eine Zelle mehrere Kontrollpunkte im Zellzyklus. Die Zelle kann hier den Zellzyklus vorübergehend arretieren, um Zeit zur Reparatur der Schäden zu gewährleisten. An der Kontrolle des Zellzyklus ist ein komplexes, interargierendes Netzwerk verschiedener regulatorischer Faktoren involviert. Im Zentrum der Regulation stehen zunächst einmal die CDKs (cyclin dependent kinase) mit ihren regulatorischen Untereinheiten, den Cyclinen. Die Assoziation der Cycline mit den CDKs bildet den ersten Schritt ihrer Aktivierung. Im zweiten Schritt muss der Cyclin-CDK-Komplex durch eine 19

26 Einleitung CAK (CDK activating kinase) phosphoryliert werden. Ein wichtiges Substrat, welches durch CDKs phosphoryliert wird, ist das Tumorsuppressorprotein prb, das Produkt des Retinoblastom-Gens. Dieses Protein hat eine wichtige Funktion im G1-Kontrollpunkt. Der G1-Kontrollpunkt, auch Restriktionspunkt genannt, ist der am besten untersuchte Kontrollpunkt. Die Rolle von p53 wird hier gut verstanden. p53 wird infolge von auftretenden DNA-Schäden phosphoryliert und kann dann als Transkriptionsfaktor die Expression des CDK-Inhibitors p21 induzieren. In normalen menschlichen Fibroblasten liegt p21 in einem quartären Komplex zusammen mit Cyclin, CDK und PCNA vor. Durch Bindung eines weiteren p21 Proteins, infolge einer verstärkten Expression, wird die Phosphorylierung und somit die Aktivierung des Cyclin-CDK-Komplexes durch die CAK verhindert (Gartel et al., 1996). Dies hat zur Folge, dass prb nicht mehr phosphoryliert werden kann. In der hypophosphorylierten Form bindet prb den Transkriptionsfaktor E2F. Erst durch die Phosphoryierung des prb durch die Cyclin-CDK-Komplexe wird seine Affinität zum E2F reduziert und so der Trankriptionsfaktor freigesetzt. Dieser induziert die Transkription wichtiger Gene, deren Produkte für den Fortgang durch die S-Phase essenziell sind (Bartek und Lukas, 2001) so z.b. Dihydrofolatreduktase, DNA-Polymerase α, Cyclin A und E, Thymidinkinase, sowie E2F selbst (zusammengefasst in Pucci und Giordano, 1999). Die Induktion von p21 kann allerdings auch in einem S-Phasenarrest resultieren. Durch seine Bindung an PCNA, eine Untereinheit, die von der Polymerase δ benötigt wird, verhindert p21 den Elongationschritt der DNA-Replikation (Waga und Stillman, 1998). Da allerdings PCNA allgemein ein für die DNA-Synthese essenzieller Faktor ist, und somit auch für eine DNA- Neusynthese infolge stattfindender Reparatur benötigt wird, wurde die Hemmung von PCNA durch p21 zunächst kontrovers diskutiert. Während Li et al. (1994) keinen inhibierenden Effekt von p21 auf die DNA-Reparatur feststellen konnten, zeigten Studien von Cooper et al. (1999), sowie von Pan et al. (1995) eine Hemmung der Reparatur. Allerdings zeigte sich hier, dass die NER im Gegensatz zu der in der S-Phase stattfindenden DNA-Replikation, weniger sensitiv gegenüber einer Hemmung durch p21 ist. Wie bereits Rhind und Russell (2000) darstellten scheint die Reihenfolge, dass zunächst die Replikation gestoppt bis anschließend durch die Reparatur der Schäden der Zellzyklus fortgesetzt wird, ein veraltetetes Modell zu sein. Vielmehr scheint der S-Phasenkontrollpunkt eine Modifikation der DNA-Replikation zur Folge zu haben, indem eine rekombinationsabhängige Reparatur aktiviert wird. Infolge von UV-Schäden kann es auch zur sogenannten PPR (post-replication repair) durch eine spezielle Polymerase η, dem Genprodukt von XPV kommen. 20

27 Fragestellung 3 Fragestellung Die kanzerogene Eigenschaft von Cadmiumverbindungen ist bekannt, dennoch sind die zu Grunde liegenden Mechanismen noch weitestgehend unklar, zumal das mutagene Potenzial nur schwach ausgeprägt ist. Empfindliche Zielstrukturen für Metallverbindungen sind Zinkbindende Domänen in so genannten Zinkfingerproteinen. Drei Prozent der Gene codieren für Zinkfingerstrukturen. Das Strukturelement ist häufig in Transkriptionsfaktoren beinhaltet. Ein wichtiger Transkriptionsfaktor mit einer Zink-bindenden Struktur ist das Tumorsuppressorprotein p53. Das Protein ist in einer Vielzahl von Mechanismen zum Schutz der Zelle beteiligt, so z.b. in der Zellzykluskontrolle, in der Apoptose, aber auch in der DNA- Reparatur. Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind Untersuchungen zum Einfluss sowohl löslicher als auch partikulärer Cadmiumverbindung auf die Struktur und die damit verbundene Funktion des Tumorsuppressorproteins p53. Ein möglicher Einfluss auf DNA-Reparaturprozesse sowie auf die Zellzykluskontrolle soll aufgeklärt werden. Da Cadmium in der Umwelt meist in partikulärer Form als CdO vorkommt ist die Abklärung der Frage, ob das Wirkspektrum von löslichem CdCl 2 dem des partikulären CdO entspricht von zentraler Bedeutung für die Risikobewertung von umweltrelevanten Cadmiumverbindungen. Ausgehend von einer Hemmung der Reparatur UV-induzierter und BPDE-induzierter DNA-Schäden, soll in Kombinationsuntersuchungen die Genexpression zweier Zielgene von p53, p48 und XPC, untersucht werden. Die Genprodukte sind in die Schadenserkennung der Nukleotidexzisionsreparatur involviert. Hierzu muss zunächst die Real Time RT-PCR- Methode etabliert werden, mit der die Amplifikation eines Oligonukleotids in Echtzeit verfolgt werden kann und quantitative Aussagen getroffen werden können. Ein weiterer wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität ist die Zellzykluskontrolle. Treten DNA-Schäden auf, muss der Zellzyklus vorübergehend angehalten werden bis die Schäden repariert sind, damit sie sich nicht infolge stattfindender DNA-Replikation in Mutationen manifestieren können. Das Genprodukt von p21 besitzt hier eine große Bedeutung und wird ebenfalls über p53 reguliert. Somit soll des Weiteren die Genexpression von p21 untersucht werden. Versuche zur Zellzyklusphasenverteilung am Durchflusszytometer in Kombinationsuntersuchungen mit UVC-Strahlung sollen letztendlich zeigen, ob Cadmiumverbindungen in die Zellzykluskontrolle eingreifen. 21

28 Material und Methoden 4 Material und Methoden Eine Auflistung von allen eingesetzten Chemikalien und Lösungen, deren Konzentrationen sowie eine Liste der verwendeten Geräte ist im Anhang zu finden. 4.1 Zellkultur Medien, Puffer, Lösungen und alle verwendeten Verbrauchsmaterialien für die Zellkultur wurden sterilfiltriert oder autoklaviert bzw. hitzesterilisiert Zellen In der vorliegenden Arbeit wurde die humane Zelllinie A549 (Lungenadenokarzinomzellen) eingesetzt. Die Zellen werden in einem Einfriermedium bestehend aus 90 % FKS (fötales Kälberserum) und 10 % DMSO bei -196 C in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Kultiviert werden sie in DMEM-Medium mit 10 % FKS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei 37 C, 5 % CO 2 -Atmosphäre und 100 % Luftfeuchtigkeit. Die Zellen wachsen als Monolayer mit einer Generationszeit von etwa 24 Stunden. Bei etwas 70 % Konfluenz werden die Zellen abtrypsiniert, in neue Schalen ausgesät und mit frischem Medium versetzt. Die Zellen werden mittels PCR auf Kontamination mit Mykoplasmen getestet Koloniebildungsfähigkeit Mit Hilfe der Koloniebildungsfähigkeit von Zellen kann die Zytotoxizität der zu untersuchenden Verbindung ermittelt werden. Hierfür wird die Zellzahl nach Ablauf der Inkubationszeit bestimmt, eine definierte Anzahl von Zellen weitergesetzt und diese unter normalen Wachstumsbedingungen mehrere Tage kultiviert. Anhand der, im Vergleich zu unbehandelten Zellen, Anzahl gebildeter Kolonien lässt sich feststellen ob und in welchen Konzentrationen das getestete Agens zu Langzeitschäden, die die Reproduktionsfähigkeit der Zellen beeinflussen, führt. 22

29 Material und Methoden Zur Untersuchung der Koloniebildungsfähigkeit werden jeweils 1 x 10 6 Zellen in eine Zellkulturschale (100 x 20 mm) mit 10 ml Kulturmedium ausgestreut. Nach einem Teilungszyklus (24 Stunden) erfolgt die Inkubation mit der zu untersuchenden Verbindung, indem die entsprechende Menge an jeweiliger Stammlösung in das Kulturmedium zupipettiert wird. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird das Medium abgenommen und die Schalen werden mit je 5 ml Medium gewaschen. Die Zellen werden abtrypsiniert, die Zellzahl wird bestimmt und jeweils 300 Zellen werden in eine Zellkulturschale (60 x 15 mm) mit 5 ml frischem Kulturmedium überführt. Nach etwa 7 Tagen im Brutschrank sind die Kolonien mit bloßem Auge sichtbar. Das Medium wird abgenommen, die Zellen werden mit PBS gewaschen und mit 2-3 ml 100 %igem Ethanol fixiert. Durch eine Blaufärbung der Kolonien mit Giemsa-Farbstoff können die Kolonien ausgezählt werden. 4.2 Behandlung der Zellen Inkubation Für die Inkubation mit dem wasserlöslichen CdCl 2 wird eine Stammlösung (10 mm) in bidestillierten Wasser angesetzt, sterilfiltriert und bei 4 C gelagert. Je nach gewünschter Endkonzentration im Kulturmedium wird nach Bestimmung des Kulturmediumvolumens die entsprechende Menge der Stammlösung zupipettiert. Die Stammsuspension des schlecht löslichen, partikulären CdO wird unmittelbar vor Versuchsbeginn hergestellt. Hierfür werden die Partikel für 30 min bei 110 C sterilisiert und anschließend die Stammsuspension (0,5 mg/ml) in bidestilliertem autoklaviertem Wasser hergestellt. Um die Teilchen nahezu vollständig und fein verteilt in Suspension zu bekommen, wird die Suspension 15 min im Ultraschallbad behandelt und im Anschluss 5 min auf dem Vibrationsmischer geschüttelt UVC-Bestrahlung Für die Kombinationsuntersuchungen wird als DNA-schädigendes Agens UVC-Strahlung (254 nm) verwendet. Vor der Bestrahlung der Probe wird mit einem Dosimeter eine Dosis- Abstands-Kurve aufgenommen, aus der dann die Bestrahlungsparameter (Entfernung der Lampe zur Zellkulturschale, Zeit der Bestrahlung) entnommen werden. 23

30 Material und Methoden Zur Bestrahlung der Zellen wird nach Beendigung der Vorinkubation bzw. nach Ablauf der Anwachsphase das Kulturmedium abgenommen und gesammelt. Um Reste des Mediums zu entfernen wird die Zellkulturschale mit PBS gespült. Zur Bestrahlung werden die Schalen ohne Deckel unter die UVC-Lampe gestellt und für 5 sec im Abstand von 30 cm bestrahlt (entsprechend einer Dosis von 5 J/m 2 ). Im Anschluss werden die Zellen mit dem jeweiligen Ursprungsmedium versetzt und im Brutschrank gelagert. 4.3 Zellzyklusmessung am Durchflusszytometer In der vorliegenden Arbeit wird die Verteilung der Zellen im Zellzyklus mit einem Durchflusszytometer bestimmt. Daher wird im Folgenden auf den Aufbau und das Messprinzip eingegangen. Ein Durchflusszytometer ist ein optisches Messsystem, mit dem Fluoreszenz- und Streulichtsignale von Zellen, die sich in Suspension befinden, analysiert werden können Geräteaufbau und Messprinzip Die sich in Suspension befindlichen Zellen werden durch einen Flüssigkeitsstrom in einer konisch zulaufenden Kapillare fokussiert (Abbildung 11). Die Abstände der Zellen voneinander vergrößern sich dadurch auf dem Weg durch die Kapillare, so dass gewährleistet ist, dass die Zellen nacheinander die Messstelle durchlaufen. Abbildung 11: Aufbau der Messküvette eines Durchflusszytometers und Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung (Dickinson, 2000). 24

31 Material und Methoden Passiert eine Zelle die Messstelle, wird sie von einem Laser bestrahlt, wodurch es zu mehreren Effekten kommt. Zum einen wird das Licht gestreut, wobei es je nach Zellgröße nach vorne (Vorwärtsstreulicht), und je nach Oberflächenbeschaffenheit zur Seite (Seitwärtsstreulicht) gestreut wird. Zum anderen kommt es durch eine vorangehende Färbung von Zellbestandteilen wie z.b. der DNA mittels eines fluoreszierenden Farbstoffes zu einem Fluoreszenzsignal. Die Intensitäten der auftretenden Emissionen werden mit Hilfe eines optischen Detektionssystems quantifiziert (Abbildung 12) (Schmitz und Rothe, 1994). Abbildung 12: Aufbau des optischen Systems eines Durchflusszytometers (Schmitz und Rothe, 1994) Fluoreszenzfärbung Für die Zellzyklusmessungen wird der DNA-Gehalt einer Zelle mittels DAPI (4, 6 - Diamidino-2-phenylindol), einem spezifischen DNA-Farbstoff, bestimmt. Hierfür werden die Zellen nach Ablauf der Inkubationszeit abtrypsiniert, gezählt und 1 x 10 6 Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Nach Zentrifugation bei 1200 rpm wird der Überstand entfernt und das Zellpellet in 1 ml PBS aufgenommen. Durch Zugabe von 3 ml 100 %igem Ethanol (-20 C) unter Schütteln auf dem Vibrationsmischer werden die Zellen fixiert und bis zur Fluoreszenzfärbung bei -20 C aufbewahrt. Am Tag vor der Messung wird erneut bei 1200 rpm abzentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Zellpellet in 1 ml DAPI-Fertiglösung durch mischen suspendiert. Bis zur Messung am Durchflusszytometer werden die Proben bei 4 C aufbewahrt. 25

32 Material und Methoden Zellzyklusmessung Die Intensität des erhaltenen Fluoreszenzsignals ist abhängig vom DNA-Gehalt der Zelle. Dieser ist wiederum abhängig davon, in welcher Phase des Zellzyklus sich die Zelle befindet. Während der G1-Phase besitzt die Zelle einen einfachen DNA-Gehalt. Im Verlauf der S- Phase kommt es auf Grund der Replikation der DNA zu einem Anstieg des DNA-Gehalts, bis am Ende der doppelte Gehalt vorliegt. Die Zelle besitzt also während der G2- und M-Phase einen doppelten DNA-Gehalt, bis sie sich teilt und somit am Ende der M-Phase zwei Zellen mit jeweils einfachem DNA-Gehalt entstehen (Abbildung 13). Abbildung 13: Änderung des DNA-Gehalts während des Zellzyklusses (Dickinson, 2000). Für die Auswertung der durchflusszyotometrischen Analyse werden die Intensitätssignale jeder Zelle, die dem DNA-Gehalt proportional sind, aufsummiert, wodurch eine Häufigkeitsverteilung erhalten wird. Mittels eines Algorithmus ermittelt die Software schließlich die einzelnen Flächen des Histogramms, die den jeweiligen Phasen des Zellzyklusses entsprechen (Abbildung 14). Abbildung 14: DNA-Histogramm einer Zellzyklusmessung (Dickinson, 2000). 26

33 Material und Methoden 4.4 Bestimmung des p53 Proteingehaltes Zur Bestimmung des p53 Proteingehaltes werden die Proteine aus den Zellen isoliert. Nach Ermittlung der Proteinkonzentration nach Bradford (Bradford, 1976) wird ein Aliquot des Zellextraktes denaturiert, auf ein SDS-Polyacrylamidgel (12 %) aufgetragen und die Proteine bei einer Spannung von 100 V aufgetrennt. Im Anschluss erfolgt der Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran. Auf jedem Gel wird ein Molekulargewichtsmarker mitgeführt der gleichzeitig auch als Kontrolle des erfolgten Proteintransfers nach dem Westernblot dient Zelllyse Zur Zelllyse werden 5 Millionen Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt und bei 1200 rpm 3 min abzentrifugiert. Das Pellet wird mit 100 µl RIPA-Puffer versetzt, in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt und im Ultraschall sonifiziert (5 x pulse). Nach Abzentrifugieren der Zelltrümmer ( rpm, 15 min) kann der Proteingehalt im Überstand bestimmt werden Proteinbestimmung nach Bradford Zur Proteinbestimmung nach Bradford werden jeweils 2 µl Proteinextrakt mit 98 µl Wasser in einer 24-Mikrotiterlochplatte vermischt (Dreifachbestimmung) und dazu 900 µl Bradfordlösung (Bio-Rad Reagenz) gegeben. Fünf Minuten nach Reagenzzugabe wird die Absorption bei 595 nm in einem Mikrotiterplattenlesegerät (TECAN SpektraFluor) bestimmt. Durch die Bindung des in der Bradfordlösung enthaltenen Farbstoffs Coomasie Brillantblau G 250 an Proteine verschiebt sich in saurer Lösung die Absorption von 465 nm nach 595 nm. Zur Berechnung der Proteinkonzentration wird auf jeder Lochplatte eine Kalibriergerade mit Rinderserumalbumin im Bereich von 1-15 µg/ml mitgeführt Elektrophorese und Westernblot 20 µg Gesamtprotein wird mit 5 µl Lämmli-Ladepuffer (4x) versetzt, mit H 2 O auf 20 µl aufgefüllt und bei 95 C für 5 min denaturiert. Im Anschluss werden die Proben auf ein denaturierendes Popyacylamidgel (5 %iges Sammelgel, 12 %iges Trenngel) aufgetragen. Die 27

34 Material und Methoden Elektrophorese erfolgt bei 80 V im Sammelgel und zur Trennung der Proteine im Trenngel bei 100 V. Als Molekulargewichtsmarker wird auf jedem Gel ein Rainbow- Molekulargewichtsmarker mitgeführt, anhand dessen Farben die 53 kd-bande des p53- Proteins zugeordnet werden kann. Zur Übertragung der Proteine auf eine PVDF-Membran werden die Proteine nach erfolgter Trennung in einer Semidry-Blot-Apparatur bei 0,8 A/cm 2 Membran für 1 h auf eine PVDF-Membran geblottet Detektion durch Chemilumineszenz Um aktive Bindungsstellen der Membran zu blockieren, wird die Membran nach dem Westernblot für 30 min in Magermilchpulver (5 % in PBS) geschwenkt. Anschließend wird die Membran für eine Stunde bei Raumtemperatur (oder bei 4 C über Nacht) mit dem Antip53-Antikörper DO-7 (Mausserum) inkubiert. Hierzu wird die Membran mit einer Lösung bestehend aus 3 µl des Antikörpers und 3 ml Blockierlösung luftblasenfrei eingeschweißt. Im Anschluss erfolgt nach jeweils dreiminütigem, viermaligem Waschen der Membran in PBS (0,3 % Tween 20) die Inkubation mit dem an Peroxidase gekoppelten Anti-Maus IgG- Antikörper. Dazu werden 1,2 µl des Antikörpers in 3 ml Blockierlösung gegeben und dies zusammen mit der Memran eingeschweißt. Nach Ablauf von einer Stunde erfolgt nach vier Waschschritten mit PBS (0,3 % Tween 20) für jeweils drei Minuten die Detektion mittels Chemilumineszenz. Hierzu wird die Membran für eine Minute mit etwa 1 ml der ECL- Lösung von Amersham (1:1 Mischung) inkubiert und im Anschluss die Reaktion der Peroxidase mit dem Substrat anhand der Chemilumineszenz detektiert Immunpräzipitation zur Konformationsbestimmung von p53 Um zwischen Wildtyp- und mutanter -Konformation von p53 unterscheiden zu können, wird eine Immunopräzipitation mit konformationsspezifischen Antikörpern durchgeführt Zelllyse und Vorklärung Die Zellen werden mit 500 µl Immunpräzipitationspuffer (4 C) lysiert, mittels Zellschaber von der Zellkulturschale abgelöst und in 2,2 ml Eppendorfreaktionsgefäße überführt. Alle nachfolgenden Arbeiten werden auf Eis durchgeführt. Die Zelltrümmer werden bei g für 5 min abzentrifugiert und der Überstand in neue Reaktionsgefäße überführt. Um unspezifische Bindungsreaktionen zu minimieren werden die Proben vorgeklärt. Hierzu wird 28

35 Material und Methoden pro Ansatz 1 µg Pab 416 zugegeben, ein Antikörper gegen das nicht in Lösung befindliche SV40T-Antigen. Um das gebildete Präzipitat aus der Lösung zu entfernen, wird 20 µl Protein A/G-Agarose-Lösung zugegeben und nach 45 min im Rotator bei g für 1 min abzentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und der Proteingehalt nach Bradford (siehe Kapitel 4.4.2) bestimmt Immunopräzipitation Zugabe von Antikörper Zugabe von Protein A/G gekoppelt an Agarose Zentrifugation Überstand Pellet Abbildung 15: Schematische Darstellung einer Immunpräzipitation. Für die Unterscheidung zwischen Wildtyp- und mutanter -p53-konformation wird der Zellextrakt nach Proteinbestimmung durch Verdünnung mit Immunpräzipitationspuffer auf gleiche Proteinmenge und Volumina eingestellt. Jede Probe wird auf verschiedene Ansätze aufgeteilt und anschließend die Immunpräzipitation mit konformationsspezifischen Antikörpern durchgeführt. Hiezu werden die entsprechenden Ansätze jeweils mit 1 µg monoklonalem Antikörper (PAb 1620 = Wildtyp, PAb 240 = mutante Konformation) und 15 µl Protein A/G-Agarose-Lösung versetzt. Nach 18 h im Rotor wird das gebildete Präzipitat bei g für 1 min abzentrifugiert (Abbildung 15). Das Pellet wird dreimal mit eiskaltem Immunpräzipitationspuffer und zuletzt einmal mit eiskaltem PBS gewaschen. Der Rückstand bestehend aus einem p53-protein-anti-p53-antikörper und Protein A/G-Agarose-Komplex wird mit Lämmli-Ladepuffer versetzt und für 10 min bei 95 C aufgekocht, wodurch der Antikörper denaturiert, das p53-protein in Lösung geht und nach erfolgter Elektrophorese mittels Westernblot und Chemilumineszensdetektion quantifiziert wird. Hierzu wird wie unter Kapitel beschrieben vorgegangen. Da der für die Immunpräzipitation verwendete, konformationsspezifische Antikörper aus der Maus stammt, wird als anti-p53-antikörper für den Westernblot ein Antikörper einer anderen Spezies (CM1 (Kaninchenserum)) eingesetzt, da sonst ein gegen Maus IgG gerichteter sekundärer Antikörper, zusätzlich die schwere Kette 29

36 Material und Methoden des denaturierten, zur konformationsspezifischen Fällung verwendeten Antikörpers erkennen würde und dies in einer Bande in Höhe des p53-proteins resultieren würde. Als sekundärer Antikörper wird somit ein mit Peroxidase gekoppelter anti-kaninchen IgG-Antikörper eingesetzt. 4.5 Bestimmung der relativen Genexpression Um Unterschiede im Expressionslevel bestimmter Gene nach Inkubation mit einer Testverbindung zu untersuchen wird eine RT-PCR durchgeführt. Hierzu wird die Gesamt- RNA aus den Zellen isoliert, in cdna umgeschrieben und die Expression des zu untersuchenden Gens mittels spezifischen Primern mit Hilfe der PCR untersucht Probenvorbereitung RNA-Isolierung Die Isolation der RNA erfolgt mittels Säulenisolationskit von BD Bioscience. Das Prinzip beruht auf einem Silikat-Filter, der Nukleinsäuren bindet und somit die RNA von Proteinen und Zellbestandteilen abtrennt. Nach DNase-Verdau und verschiedenen Waschschritten kann die RNA von der Säule eluiert werden. Es werden jeweils 1 x 10 6 Zellen in eine Zellkulturschale (100 x 20 mm) mit 10 ml Kulturmedium ausgestreut. Nach einem Teilungszyklus (24 Stunden) erfolgt die Inkubation mit der zu untersuchenden Verbindung. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Zellen abtrypsiniert, die Zellzahl bestimmt und 2 x 10 6 Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt, bei 1200 rpm abzentrifugiert und der Überstand abgenommen. Das Zellpellet wird in 1 ml PBS resuspendiert, in ein 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäß überführt und erneut bei 1200 rpm abzentrifugiert. Nach Abnehmen des Überstandes wird das Pellet mit 350 µl Lysepuffer (R1-Puffer) und 3,5 µl Mercaptoethanol versetzt und durch fünfmaliges Aufziehen durch eine Kanüle ( 0,4 mm) geschert. Im Anschluss wird das gleiche Volumen 70 %iges Ethanol zugegeben, gemischt, die gesamte Lösung auf ein Reaktionsgefäß mit Filtereinsatz überführt und bei 9000 g für 30 sec abzentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen und die Säule mit 350 µl MDB-Puffer (membrane desalting buffer) versetzt. Nach Abzentrifugieren bei rpm für 1 min wird der Durchlauf erneut verworfen und ein DNase-Verdau auf der Säule durchgeführt. Hierzu werden 95 µl DNase Reaktionsgemisch (10 µl DNase + 90 µl 30

37 Material und Methoden DNase Reaktionspuffer) 15 min bei Raumtemperatur auf die Säule gegeben. Daraufhin werden zum Abstoppen 200 µl RA2-Puffer auf den Filter gegeben und 30 sec bei rpm zentrifugiert. Die Säule wird im Anschluss auf ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 600 µl RA3-Puffer gewaschen. Nach Zentrifugieren für 30 sec bei rpm wird der Durchlauf verworfen und die Säule ein zweites Mal mit RA3-Puffer (250 µl) gewaschen. Nach Zentrifugation für 2 min bei rpm wird die RNA durch zweimaliges zentrifugieren mit je 50 µl RNase freiem Wasser bei rpm von der Säule eluiert. Die Lagerung erfolgt bei -80 C Photometrische Konzentrationsbestimmung Zur Konzentrationsbestimmung der isolierten RNA wird zunächst eine 1:50 Verdünnung hergestellt. Hierfür werden 98 µl Wasser mit 2 µl der RNA-Lösung versetzt und im Anschluss die Extinktion der verdünnten Lösung bei 260 nm bestimmt. 1 OD 260nm = 40 µg RNA RNA Gelelektrophorese Zur Überprüfung der Integrität der isolierten RNA wird eine denaturierende RNA Gelelektrophorese durchgeführt. Hierzu wird ein 1,2 %iges formaldehydhaltiges Agarosegel hergestellt. Es werden 1,2 g Agarose mit 83 µl Wasser und 5 ml 20 x MOPS-Puffer aufgekocht und nach Abkühlung auf ca. 65 C mit 12 ml Formaldehydlösung (37 %) versetzt. 1 µg der isolierten Gesamt-RNA wird mit FDP (Formamid-Denaturierungs-Puffer) auf 15 µl Gesamtvolumen gebracht und 10 min bei 65 C auf dem Heizblock denaturiert, so dass die RNA einzelsträngig vorliegt. Nach Zugabe von ca. 1,5 µl Lämmli-Ladepuffer erfolgt die Eletrophorese mit MOPS (1x) bei 60 V für ca. 2 h. Zur Detektion wird das Gel bei 520 nm abfotografiert cdna-synthese Die Synthese der cdna erfolgt mittels cdna-synthesekit von Bio-Rad, welches auf einer modifizierten MMLV reversen Transkriptase mit RNAse H+-Aktivität sowie einem Gemisch aus Oligo(dT)- und random hexamer Primern basiert (Abbildung 16). 31

38 Material und Methoden aaaaa-3 mrna Oligo-dT aaaaa-3 ttttt-5 Reverse Transkriptase aaaaa ttttt-5 cdna Abbildung 16: Schema der cdna-synthese. Der Reaktionsansatz wird bei 4 C im Eisblock nach folgendem Pipettierschema pipettiert: 15 x µl RNase freies Wasser x µl (entsprechend 1 µg) RNA-Probe 4 µl 5 x iscript Reaktiongemisch 1 µl iscript Reverse Transkriptase Dieser Ansatz wird bei 25 C für 5 min inkubiert, damit sich die Primer an die einzelsträngige RNA anlagern. Im Anschluss erfolgt bei 42 C die reverse Transkrition für 30 min. Durch eine Erhitzung auf 85 C für 5 min wird die Reaktion letztendlich beendet und die synthetisierte cdna kann für die PCR eingesetzt werden Quantitative Real Time PCR Prinzip Die PCR (Polymerase Chain Reaction) wurde 1985 von K. B. Mullis entwickelt und dient zur in vitro Vervielfältigung von Nukleinsäuren. Das Reaktionsprinzip ist die enzymatische Amplifizierung eines DNA-Abschnittes zwischen zwei Oligonukleotidprimern, die gegenläufig an komplementären DNA-Strängen gebunden sind und den zu amplifizierenden DNA-Abschnitt begrenzen. Die Reaktion basiert auf einer zyklischen Wiederholung von drei Schritten: Denaturierung, Annealing und Elongation (Abbildung 17). 32

39 Material und Methoden tgcaccaccaactgcttagc acgtggtggttgacgaatcg Denaturierung tgcaccaccaactgcttagc acgtggtggttgacgaatcg Annealing tgcaccaccaactgcttagc cgaatcg tgcacca x acgtggtggttgacgaatcg Elongation tgcaccaccaactgcttagc acgtggtggttgacgaatcg-5 X + X 5 -tgcaccaccaactgcttagc acgtggtggttgacgaatcg Abbildung 17: Schema einer Polymerasekettenkeaktion (PCR). Während der Denaturierungsphase wird der DNA-Doppelstrang aufgrund der Aufspaltung der Wasserstoffbrücken durch hohe Temperatur zwischen den gegenüberliegenden Basenpaaren aufgetrennt, so dass sich im nächsten Schritt, der Annealingsphase, die Primer an komplementäre Sequenzen anlagern können. Im letzten Schritt kommt es bei 72 C, dem Temperaturoptimum der Polymerase, zur Elongation d.h. zur Auffüllung der Stränge mit Nukleotiden. In jedem Zyklus kommt es so zu einer Verdopplung der eingesetzten DNA- Menge. Diese exponentielle Zunahme lässt sich mit folgender Gleichung beschreiben: 33

40 Material und Methoden N = N 0 x (1 + E) n N 0 Anfangsmenge der DNA N Menge an Amplifikat nach n Zyklen n Anzahl der Zyklen E Effizienz der PCR Aufgrund einer Konkurrenzreaktion zwischen Strang-Reannealing und Primer-Annealing bei höheren Zyklenzahlen, sowie aufgrund einer Inaktivierung der Polymerase durch thermische Belastung sowie durch Akkumulation von Pyrophosphat, das sich während der Reaktion bildet, kommt es bei fortlaufender Reaktion zu einer Plateaubildung (Köhler, 1995; Mülhardt, 2003). Für eine Quantifizierung ist es entscheidend, den Zyklenbereich festzulegen, in dem ein linearer Zusammenhang zwischen Ampifikatbildung und Zyklenzahl besteht. Der Vorteil der Real Time PCR gegenüber der herkömmlichen PCR ist die Möglichkeit, den gesamten Amplifikationsvorgang online zu verfolgen (Abbildung 18). A B Abbildung 18: Vergleich densitometrische Auswertung konventioneller PCR (A) mit online-auswertung bei der Real Time PCR (B). Hierzu wurden in den letzten Jahren verschiedene Methoden entwickelt, die auf dem Einsatz unterschiedlicher Fluorophore beruhen. Gemessen wird dabei die direkt oder indirekt mit der DNA-Amplifikation verbundene Fluoreszenz, während bei der konventionellen PCR die Proben nach einer definierten Zyklenzahl densitometrisch nach erfolgter Elektrophorese vermessen werden (Bustin, 2000). In der hier vorliegenden Arbeit wird die DNA- Amplifikation durch den Einsatz des Fluoreszensfarbstoff SYBR Green ermittelt. Hierbei handelt es sich um einen Fluoreszenzfarbstoff, der unspezifisch in doppelsträngige DNA 34

41 Material und Methoden interkaliert und somit mit fortschreitender Zyklenzahl zu einem Fluoreszenzanstieg führt (Abbildung 19). Abbildung 19: Interkalation des Fluoreszenzfarbstoffs SYBR Green während der Elongation durch die DNA-Polymerase. Für den Probenansatz werden pro Reaktionsgefäß 12,5 µl SYBR Green Supermix 10,5 µl Wasser 0,5 µl forward Primer 0,5 µl reverse Primer 1 µl cdna eingesetzt. Um Pipettierfehler zu minimieren, wird für jede zu untersuchende cdna-probe ein Mastermix angesetzt, der Supermix, cdna und Wasser enthält. Dieser wird dann auf die verschiedenen Ansätze verteilt (Gen X, Housekeeping Gen) und im Anschluss werden die Primerpaare zugegeben. 35

42 Material und Methoden Geräteaufbau Der Aufbau des optischen Systems icycler von Bio-Rad ist in Abbildung 20 dargestellt. Die Proben werden mit Hilfe des Anregungsfilters mit einer Wellenlänge von 494 nm bestrahlt und das emittierte Fluoreszenzlicht bei 521 nm wird am Detektor erfasst. 1 Wolfram-Lampe 2a/2b Filterrad mit 5 Positionen für Anregungs(2a)- bzw. Emissions(2b)-Filter 3 Verstärker der Lichtintensität 4 Probenplatte 5 CCD (charge-coupled device)-detektor Abbildung 20: Aufbau des icycler von Bio-Rad Effizienzbestimmung Für optimierte Reaktionsbedingungen erhält man je nach zu untersuchendem Gen in der Regel Effizienzen der PCR im Bereich von 0,78 bis 0,97 (Köhler, 1995). Die Effizienz der Reaktion hängt u.a. von der Amplifikationslänge (kurze Amplifikate liefern größere Effizienzen), von evtl. im Amplikon enthaltenen Sekundärstrukturen und vom G/C-Gehalt des Amplikons ab. Geringere Effizienzen weisen auf eine nicht optimale PCR-Reaktion hin. Auch Effizienzen größer 2, also größer 100 % sind bei der Verwendung von SYBR Green möglich. Dies weist daraufhin, dass zusätzlich zu dem spezifischen zu untersuchenden Gen ein weiteres unspezifisches Produkt gebildet wird. Daher ist es notwendig zunächst die Effizienzen zu bestimmen und evtl. die PCR-Bedingungen (Annealingtemperatur, Annealingzeit, eingesetzte Primer) zu optimieren. Bei der Wahl der Primerpaare ist es wichtig verschiedene Eigenschaften zu gewährleisten. Zum einen sollten sie eine Länge von 15 bis 20 Basen und einen G/C-Gehalt zwischen 50 und 60 %. besitzen. Um die Bildung von Primer- Dimeren zu verhindern ist zum anderen darauf zu achten, dass forward und reverse Primer keine 3 komplementären Strukturen aufweisen. Eine zusätzliche Amplifizierung von eventuell in der Probe enthaltenen DNA-Verunreinigung sollte durch Verwendung von Intron-überspannenden Primern verhindert werden (Gassen, 1994; Köhler, 1995). 36

43 Material und Methoden Die Effizienz lässt sich durch verschiedene Methoden bestimmen (Pfaffl, 1994): anhand einer Verdünnungsreihe anhand des absoluten Fluoreszenzanstiegs anhand mathematischer Algorithmen In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Effizienz anhand einer Verdünnungsreihe bestimmt. Daher wird im Folgenden näher darauf eingegangen. A B Abbildung 21: Real Time PCR-Analyse einer hergestellten cdna-verdünnungsreihe (A) mit daraus resultierender Auswertung (B). 37

44 Material und Methoden Zunächst wird aus den zu untersuchenden cdna-proben eine Mischprobe hergestellt, in dem die verschiedenen cdna-proben zu gleichen Teilen miteinander versetzt werden. Nach Herstellung einer Verdünnungsreihe wird nach abgeschlossener PCR (Abbildung 21 A) die eingesetzte cdna-menge in einer logarithmischen Funktion gegen den so genannten Ct-Wert (Thresholdcycle) dargestellt (Abbildung 21 B). Die Ct-Werte entsprechen der Anzahl der Zyklen die nötig sind, um ein konstant festgelegtes Fluoreszensniveau zu erreichen. Bei diesem Wert befindet sich in allen Reaktionsgefäßen die gleiche Menge an neu synthetisierter DNA. Daher ist die Zahl der Zyklen, die für die amplifikationsbedingte Fluoreszenzzunahme zum Erreichen des Ct-Wertes erforderlich sind, invers proportional zu der Menge an ursprünglich eingesetzter DNA. Die Effizienz (E) errechnet sich aus der Steigung (m) der erhaltenen Geraden nach folgender Gleichung: 1 m E = 10 1 (Ginzinger, 2002) PCR-Protokoll Die Real Time PCR-Analyse erfolgt über die icycler Real-Time PCR Detection Software von Bio-Rad. Das angewendete Analysenprogramm ist in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: PCR-Analysenprotokoll. Cycle (Anzahl) Step Prozess Temperatur ( C) Zeit (min) Cycle 1 (1x) Step 1 Aktivierung der Polymerase 95 01:30 Cycle 2 (37x) Datengewinnung und Echtzeitanalyse Step 1 Step 2 Step 3 Denaturierung Primer-Anlagerung Elongation :30 00:30 00:30 Cycle 3 (1x) Step 1 Denaturierung 95 01:00 Cycle 4 (1x) Step 1 Zusammenlagerung 60 01:00 Cycle 5 (70x) Datengewinnung und Echtzeitanalyse Cycle 6 (1x) Step 1 langsame Denaturierung 60 Steigerung der Temperatur nach Zyklus 2 um 0,5ºC/10 sec 00:10 Step 1 Ende 4 38

45 Material und Methoden Schmelzkurvenanalyse Da es sich bei SYBR Green um eine unspezifische Interkalation handelt, wird bei dem Fluoreszenzanstieg auch die Amplifikation unspezifischer Produkte wie z.b. die Bildung von Primer-Dimeren oder die Bildung unspezifischer PCR-Produkte aufgrund unspezifischer Primer-Bindung an die DNA erfasst. Daher muss nach abgeschlossener PCR die Spezifität überprüft werden und evtl. müssen die PCR-Bedingungen (Annealingtemperatur, Annealingzeit, eingesetzte Primer) optimiert werden. A B A B Abbildung 22: Schmelzkurve (A) mit erhaltener Ableitungsfunktion (B). Die mit SYBR Green markierten PCR-Produkte werden durch Erhöhung der Temperatur kontinuierlich bis zu ihrem definierten Schmelzpunkt denaturiert. Dies führt zu einer Abnahme der Fluoreszenz. Die Ableitungsfunktion der relativen Fluoreszenzänderung über die Temperatur (-drfu/dt) weist am Schmelzpunkt ein Maximum auf. Eine Differenzierung zwischen spezifischen und unspezifischen Produkten kann weitgehend über eine Schmelzkurvenanalyse erfolgen (Abbildung 22). Hierbei werden die PCR-Produkte nach abgeschlossener PCR kontinuierlich über einen bestimmten Temperaturbereich 39

46 Material und Methoden aufgeheizt. Währenddessen kommt es zu einer Denaturierung der Doppelstränge, wobei die Denaturierungstemperatur u.a. von der Länge des PCR-Produktes abhängt. Am Schmelzpunkt des Amplifikats kommt es zu einer schlagartigen Abnahme des Fluoreszenzsignals was sich in der Ableitungsfunktion der Fluoreszenz gegenüber der Temperatur als Peakmaximum detektieren lässt Relative Quantifizierung Als Maß für die Quantifizierung werden die Ct-Werte herangezogen. Im Falle einer 100 %igen Effizienz der Reaktion verdoppelt sich die Anzahl der DNA-Stränge während der exponentiellen Phase der PCR mit jedem Zyklus. Eine Probe, die zu Reaktionsbeginn doppelt so viele DNA-Moleküle wie die Vergleichsprobe enthält, benötigt somit einen Zyklus weniger, um den gleichen Ct-Wert zu erreichen. Anhand der unterschiedlichen Ct-Werte der beiden Proben lässt sich also der relative Unterschied des Nukleinsäure-Gehaltes zwischen den Proben berechnen (Walker, 2002). Aufgrund von Schwankungen während der cdna-synthese und um Pipettierfehler beim Einsatz der RNA-Menge für die cdna-synthese zu vermeiden, wird zusätzlich zu dem zu untersuchenden Gen ein weiteres, so genanntes Housekeeping-Gen untersucht (Abbildung 23 und Abbildung 24). Hierbei handelt es sich um ein Gen, bei dem davon ausgegangen wird, dass es unabhängig von äußeren Einflüssen d.h. unabhängig von der Behandlung der Zellen, exprimiert wird. In der hier vorliegenden Arbeit wurde als Housekeeping-Gen GAPDH (Glycerinaldehyd-3-Phosphat-dehydrogenase), einem Enzym, das in der Glykolyse beteiligt ist, verwendet. Die für das zu untersuchende Gen erhaltenen Ct-Werte werden somit im Endeffekt auf die für das Housekeeping-Gen erhaltenen Ct-Werte normalisiert. Mit der in Kapitel gezeigten Gleichung für den exponentiellen Reaktionsverlauf lässt sich somit die relative Expression (R) der behandelten Probe in Bezug auf die unbehandelte Kontrolle darstellen (Livak und Schmittgen, 2001; Pfaffl, 2001): (1 + E R = (1 + E Gen X GAPDH ( Ct ) ( Ct ) Kontrolle, Gen X Kontrolle, GAPDH Ct Ct Behandelt, Gen X ) Behandelt, GAPDH ) 40

47 Material und Methoden Threshold Ct GAPDH Ct Gen X Abbildung 23: relative Quantifizierung Kontrolle Behandelt Zellen RNA cdna PCR Kontrolle, GAPDH Kontrolle, Gen X Behandelt, GAPDH Behandelt, Gen X Abbildung 24: Fließdiagramm 41

48 Ergebnisse und Diskussion 5 Ergebnisse und Diskussion Im Vordergrund dieser Arbeit stand zunächst die Etablierung der Real Time RT-PCR- Methode. Daher wird zuerst auf die Validierung der Messmethode eingegangen, bevor im Anschluss die Effekte des für die Untersuchungen zur NER eingesetzten schädigenden Agens UVC-Strahlung gezeigt werden. Um später auf die Wirkung von Cadmiumverbindungen in Kombination mit UVC einzugehen, werden zuvor die Ergebnisse der jeweiligen Verbindung aus den unterschiedlichen Teilbereichen der Fragestellung vorgestellt. 5.1 Messungen mit der Real Time PCR Um die Eignung der Methode für die Analyse der Genexpression nachzuweisen, wurden für jedes zu untersuchende Gen die Spezifität des Primers mittels Schmelzkurvenanalyse und die Linearität mit Hilfe einer cdna-verdünungsreihe untersucht Schmelzkurvenanalyse Zur Untersuchung der Spezifität der eingesetzten Primer, wurde nach abgeschlossener PCR- Reaktion eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Bei den eingesetzten Primerpaaren wurde darauf geachtet, dass keine komplementären Strukturen enthalten sind, die zu einer Primer-Dimer-Bildung führen, und so in einer Primer- Amplifizierung resultieren könnten. Dies würde sich in einem zusätzlichen Schmelzpunkt bei niedrigeren Temperaturen zeigen. Analog hierzu würde auch die Amplifikation unspezifischer Produkte in der Schmelzkurvenanalyse zu zusätzlichen Peaks führen. Eine Vervielfältigung von DNA-Verunreinigungen in der Probe würde sich in einem zusätzlichen Peak oberhalb des spezifischen mrna-peaks zeigen, da DNA aufgrund der enthaltenen Introns zu längeren PCR-Produkten führt und somit höhere Temperaturen zur Denaturierung nötig sind. Um eine Vervielfältigung von DNA zu vermeiden, wurden die RNA-Proben zum einen einem DNAse- Verdau unterzogen, zum anderen wurden möglichst Intron-übergreifende Primer eingesetzt. Alle zu untersuchenden Gene wiesen nur einen Schmelzpunkt auf, was auf die Spezifität der eingesetzten Primer schließen lässt (Abbildung 25). Wie in Tabelle 3 zu erkennen ist, korrelierte die Länge des Amplifikats mit der Höhe des Schmelzpunktes. So denaturierte p21 42

49 Ergebnisse und Diskussion mit der geringsten Länge von 90 Basenpaaren bereits bei 84,5 C, während XPC mit einer Länge von 112 Basenpaaren einen Schmelzpunkt von 87 C hatte. Die Schmelztemperatur hängt allerdings nicht nur von der Länge, sondern zusätzlich auch vom G/C-Gehalt des Amplifikats ab. Zwischen G/C kommt es zur Ausbildung von drei Wasserstoffbrücken im Gegensatz zu zwei, die zwischen A/T gebildet werden. Hohe G/C-Anteile benötigen somit höhere Temperaturen zur Denaturierung als A/T-Bereiche. A B C D Abbildung 25: Schmelzkurvenanalyse der Amplifikate von GAPDH (A), XPC (B), p21 (C), p48 (D). Die mit SYBR Green markierten PCR-Produkte wurden durch Erhöhung der Temperatur kontinuierlich bis zu ihrem definierten Schmelzpunkt denaturiert. Dies führt zu einer Abnahme der Fluoreszenz. Die Ableitungsfunktion der relativen Fluoreszenzänderung über die Temperatur (-drfu/dt) weist am Schmelzpunkt ein Maximum auf. Tabelle 3: Eigenschaften der amplifizierten Templates. Gen Amplifikatlänge (bp) Schmelztemperatur ( C) GAPDH 90 84,5 p XPC p ,5 43

50 Ergebnisse und Diskussion Effizienzbestimmung Zur Überprüfung der Linearität und Sensitivität wurde die Amplifikation der cdna mittels einer seriellen cdna-verdünnung gemessen. Die ermittelten Effizienzen für die untersuchten Gene sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4: Effizienzbestimmung mittels cdna-verdünnungreihe. Gen Effizienz (%) GAPDH 93,6 p48 101,0 XPC 92,9 p21 83,7 In der Literatur werden für optimierte Reaktionsbedingungen je nach zu untersuchendem Gen in der Regel Effizienzen im Bereich von 78 bis 97 % angegeben (Köhler, 1995). Die Effizienz der Reaktion hängt u.a. von der Amplifikationslänge, evtl. im Amplikon enthaltenen Sekundärstrukturen und vom GC-Gehalt des Amplikons ab. Geringere Effizienzen weisen auf eine nicht optimale PCR-Reaktion hin. Auch Effizienzen größer 1, also größer 100 % sind bei der Verwendung von SYBR Green möglich. Dies weist daraufhin, dass zusätzlich zu dem spezifischen zu untersuchenden Gen ein weiteres unspezifisches Produkt gebildet wird. Sowohl die Ergebnisse der Schmelzkurvenanalyse als auch die erhaltenden Effizienzen verdeutlichen, dass die zugrunde liegenden PCR-Bedingungen (Annealingtemperatur, Annealingzeit, eingesetzte Primer) geeignet sind für das verwendete Testsystem. 44

51 Ergebnisse und Diskussion 5.2 UVC-Bestrahlung Zur Untersuchung der über die NER vermittelten Beseitigung sperriger DNA-Addukte wird als DNA-schädigendes Agens UVC-Strahlung eingesetzt. Da das Absorptionsmaximum der DNA bei 260 nm liegt und somit die photochemische Reaktion durch UVC-Strahlung sehr effizient ist, wird in den meisten Studien UVC-Strahlung angewendet. Durch UVC-Strahlung wird ein gut definiertes Schadensspektrum erhalten, so kommt es vorwiegend zur Bildung von CPDs und (6-4)-Photoprodukten (Ravanat et al., 2001). Im Folgenden werden die Einflüsse von UVC-Strahlung auf die Koloniebildungsfähigkeit, die Zellzyklusphasenverteilung, den p53-gehalt und die Genexpression von durch p53 regulierten Genen (p48, XPC, p21) gezeigt Koloniebildung Zur Abschätzung der Bestrahlungsdosis, die zum einen eine genügend große Zahl an Schäden verursacht, zum anderen aber das Überleben eines großen Anteils der Zellen sicherstellt, wurde die Zytotoxizität der UVC-Strahlung anhand der Koloniebildungsfähigkeit in einem Dosisbereich von 0 bis 20 J/m 2 ermittelt. Abbildung 26: Koloniebildungsfähigkeit von A549 Zellen nach UVC-Bestrahlung. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD. 45

52 Ergebnisse und Diskussion UVC-Bestrahlung führte zu einer rapiden Abnahme der Koloniebildungsfähigkeit mit zunehmender UVC-Dosis. Während eine Bestrahlung mit 5 J/m 2 noch in einer Koloniebildungsfähigkeit über 70 % im Vergleich zu unbestrahlten Kontrollzellen resultierte, war die Anzahl der Kolonien nach einer Behandlung mit 7,5 J/m 2 nur noch bei etwa 50 % (Abbildung 26). Für die nachfolgenden Versuche wurde eine UVC-Dosis von 5 J/m 2 eingesetzt Induktion von p53 Das Protein p53 besitzt in ungestressten Zellen aufgrund eines ständigen Ubiquitinvermittelten mdm2-abhängigen Abbaus eine geringe Halbwertszeit von 15 bis 20 Minuten. Infolge von DNA-Schäden wird die Bindung von mdm2 an p53 durch Phosphorylierung in der N-teminalen Transaktivierungsdomäne des p53 verhindert und somit der Abbau von p53 reduziert (zusammengefasst in Alarcon-Vargas und Ronai, 2002; Giaccia und Kastan, 1998). UVC-Strahlung generiert DNA-Addukte (CPDs und (6-4)-Photoprodukte). Zur Untersuchung der zeitabhängigen Induktion des p53-gehaltes in Folge der UVC-Bestrahlung, wurde der p53-protein-gehalt zu verschiedenen Zeitpunkten nach einer UVC-Bestrahlung durch eine Westernblot-Analyse mittels eines monoklonalen Antikörpers gegen p53 bei einer Dosis von 5 J/m 2 bestimmt. Es zeigte sich eine starke Induktion des p53-protein-gehalts mit einem Maximalgehalt drei Stunden nach der Bestrahlung. Daraufhin führte die Bestrahlung zu einer Abnahme an p53, bis nach etwa 24 Stunden wieder annähernd das Niveau unbestrahlter Zellen erreicht wurde (Abbildung 27). Zeit nach UVC- Bestrahlung (h) Abbildung 27: Westernblot nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m 2. Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m 2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde ein Westernblot mit anti-p53-antikörper DO-7 aus dem Zelllysat durchgeführt. Dargestellt ist ein Westernblot. Insgesamt wurden drei unabhängige Versuche durchgeführt, die alle das gleiche Ergebnis aufwiesen. 46

53 Ergebnisse und Diskussion Von einer Induktion von p53 in Folge von UVC-Stahlung berichteten ebenfalls Untersuchungen von Ford und Hanawalt (1997) in menschlichen Fibroblasten. Allerdings zeigten diese Zellen bei einer Bestrahlungsdosis von 20 J/m 2 eine etwas verzögerte Induktion mit einem Maximum zwischen 12 und 24 h. Dies könnte auf die in der Studie verwendete primäre Zelllinie und somit längeren Generationszeit im Vergleich zu der in der hier vorliegenden Arbeit verwendeten A549 Zellen zurückzuführen sein. Ebenfalls konnten Studien von Hwang et al. (1999) sowie von Adimoolam und Ford (2002) und Adimoolam et al. (2001) eine Induktion von p53 durch UV-Strahlung nachweisen. Der genaue Mechanismus für die Auslösung der Phosphorylierung und damit der Aktivierung von p53 infolge von UVC- induzierter Schäden ist nicht bekannt. Dagegen gut untersucht ist die Aktivierung infolge von -Strahlung. Hier scheint der so genannten ATM (Ataxia Telangiectasia mutated)-kinase eine große Bedeutung zuzukommen. -Strahlung führt zur Bildung von Strangbrüchen, die eine Aktivierung der ATM und somit eine Phosphorylierung von p53 zur Folge haben. Während AT-Zellen, in denen das Gen, das für ATM codiert, mutiert ist, eine verzögerte Phosphorylierung von p53 infolge von -Strahlung aufweisen, ist die Aktivierung von p53 durch UV-Strahlung unbeeinflusst. Bei durch UV-Strahlung induzierten Schäden spielt die so genannte ATR (Ataxia Telengiectasia Related)-Kinase eine Rolle (zusammengefasst in Abraham, 2001; Caspari, 2000; Tibbetts et al., 1999). Der genaue Auslöser für die p53-phosphorylierung durch ATR ist allerdings nicht bekannt. Kaufmann und Paules (1996) sowie Nelson und Kastan (1994) vermuten die Bildung von DNA- Strangbrüchen, die kurzfristig während der Reparatur der durch UV-Strahlung induzierten Photoprodukte gebildet werden. Allerdings führt eine Bestrahlung von XPA defizienten Zellen ebenfalls zu einer p53-akkumulation und dies bei geringeren UV-Dosen als für normale Zellen zur Aktivierung nötig sind. In diesen Zellen ist allerdings die Schadenserkennung und folglich auch die Inzision der DNA verhindert, so dass keine intermediär gebildeten Strangbrüche infolge einer stattfindenden Reparatur entstehen können. Dem gegenüber zeigen XPC defiziente Zellen, in denen nur die globale genomische Reparatur beeinflusst ist, nicht aber die transkriptionsgekoppelte Reparatur, keine verstärkte p53 Aktivierung im Vergleich zu normalen Zellen. Diese Ergebnisse sowie die Beobachtung, dass eine Blockierung der Transkription durch den RNA Polymerase Inhibitor α-amanitin ebenfalls zu einer p53 Akkumulation führt, lassen die Vermutung zu, dass DNA-Schäden in aktiv transkribierten Genen der Auslöser der Aktivierung von p53 sein könnten (Yamaizumi und Sugano, 1994; Ljungman und Zhang, 1996; Dumaz et al., 1997). 47

54 Ergebnisse und Diskussion Genexpression von p21, p48 und XPC p53 ist als Transkriptionsfaktor an der Expression einer Vielzahl von Genen involviert. Zur Untersuchung der Auswirkung des erhöhten Proteingehaltes infolge der UVC-Bestrahlung auf die Expression seiner Zielgene, wurde die Genexpression verschiedener, durch p53 regulierter Gene mittels Real Time RT-PCR untersucht p21 Für p21, ein Gen dessen Produkt in der Zellzykluskontrolle eine Rolle spielt, ist die p53- abhängige Induktion in Folge von DNA-Schäden schon lange bekannt. Es zeigte sich ein zeitabhängiger Verlauf des p21 mrna-gehaltes in Folge einer UVC-Bestrahlung mit 5 J/m 2. Abbildung 28: Relative Genexpression von p21 nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m 2. Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m 2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p21 relativ zu unbehandelten Kontrollzellen aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD. Zunächst führte die Bestrahlung zu einer Induktion der Genexpression relativ zur auf 1 normierten Kontrolle. Zwischen drei und zehn Stunden nach der Bestrahlung wurden Maximalwerte von vier- bis fünffach erhöhten mrna Gehalten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle erreicht. Ab 12 Stunden fand ein Rückgang der Genexpression statt 48

55 Ergebnisse und Diskussion und erreichte nach etwa 18 Stunden einen noch etwa doppelten Wert im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle, der bis hin zu 24 Stunden erhalten blieb (Abbildung 28) p48 Zur Untersuchung der Kinetik der Induktion von p48 in den in der vorliegenden Arbeit verwendeten menschlichen Lungenkrebszellen wurde die Genexpression mittels Real Time RT-PCR ermittelt. Die UVC-Bestrahlung mit 5 J/m 2 verursachte eine zeitabhängige Steigerung der Genexpression von p48 mit einer Verdopplung der mrna-menge im Vergleich zu unbestrahlten Zellen nach etwa 10 bis 12 Stunden. Ab etwa 18 Stunden nach der Bestrahlung näherte sich die Genexpression bis hin zu 24 Stunden dem Ausgangwert von unbehandelten Kontrollzellen (Abbildung 29). Abbildung 29: Relative Genexpression von p48 nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m 2. Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m 2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p48 relativ zu unbehandelten Kontrollzellen aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD. Analog hierzu zeigten auch die Ergebnisse von Hwang et al. (1999) eine zeitabhängige Induktion der mrna von p48 durch UV-Strahlung in menschlichen Lungenfibroblasten. Hier wurde von einer etwa zweifachen Induktion der Genexpression 16 Stunden nach der 49

56 Ergebnisse und Diskussion Bestrahlung im Vergleich zu unbestrahlten Zellen berichtet. Somit entsprechen die Absolutwerte der maximalen Induktion der in dieser Arbeit ermittelten relativen Genexpression. Die im Vergleich zu den hier gezeigten Ergebnissen verzögerte Induktion von p48, könnte auf der in der Studie eingesetzten primären Ziellinie und somit längeren Generationszeit zurückzuführen sein XPC Ein weiteres Gen, dessen Expression durch p53 reguliert wird, ist das XPC. Eine UVC- Bestrahlung mit 5 J/m 2 führte zunächst zu einer gesteigerten Expression, die etwa sechs Stunden nach der Bestrahlung einen Maximalwert erreichte und im Vergleich zur unbestrahlten Zellen einen doppelt so hohen mrna-gehalt aufwies. Die mrna-menge nahm daraufhin nach etwa 12 Stunden ab, blieb allerdings bis hin zu 24 Stunden nach der Bestrahlung auf im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle erhöhten Werten (Abbildung 30). Abbildung 30: Relative Genexpression von XPC nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m 2. Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m 2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von XPC relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD. Die Ergebnisse sind im Einklang mit Versuchen von Adimoolam und Ford (2002), in denen eine Zeit- und p53-abhängige Induktion von XPC infolge einer UVC-Bestrahlung gezeigt wurde. 50

57 Ergebnisse und Diskussion Zellzyklusphasenverteilung Ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität ist die Zellzykluskontrolle. Treten DNA-Schäden auf, werden so genannte Kontrollpunkte aktiviert, um einen Übergang der Zelle in die nächste Phase des Zellzyklus zu verhindern. Um zu untersuchen, ob die durch UVC-Strahlung induzierten Photoprodukte zu einer Aktivierung von Kontrollpunkten führen, wurde die Zellzyklusphasenverteilung von A549 Zellen nach einer Bestrahlung mit 5 J/m 2 ermittelt. Hierzu wurden die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Bestrahlung fixiert, die DNA mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI gefärbt und schließlich die vom DNA-Gehalt abhängige Fluoreszenz am Durchlusszytometer bestimmt. Problematisch ist allerdings die Anzahl der ausgestreuten Zellen pro Zellkulturschale. Bei zu großer Konfluenz kommt es aufgrund der Kontaktinhibition zu einem Wachstumsstopp, der sich in einem zunehmenden Anteil der G1-Phase bemerkbar macht (Tabelle 5). Um allerdings zum Zeitpunkt des Bestrahlens gleiche Bedingungen und damit gleiche Konfluenz zu gewährleisten, muss die ausgestreute Zellzahl möglichst gering gewählt werden, um im gesamten Messbereich keine Konfluenz der Schale zu erhalten. Tabelle 5: Einfluss der Konfluenz auf die Zellzyklusphasenverteilung in A549 Zellen. Anzahl Zellen (10 5 ) G1 S G2 4 55,7 29,3 15, ,3 24,5 14, ,8 18,6 10, ,9 13,7 10,4 In Abbildung 31 ist der Anteil der Zellen in den jeweiligen Phasen des Zellzyklus gegen die Zeit nach der UVC-Bestrahlung mit 5 J/m 2 aufgetragen. Es ist deutlich zu erkennen, dass die Bestrahlung nach etwa sechs Stunden zu einer Zunahme des Anteils der Zellen in der S-Phase führte, während im gleichen Maße der G1-Phasenanteil abnahm. Der maximale Anteil der Zellen in der S-Phase zeigte sich im Bereich von zehn bis zwölf Stunden. In den darauf folgenden Stunden näherten sich die Anteile der Zellen in den jeweiligen Phasen denen der 51

58 Ergebnisse und Diskussion unbehandelten Kontrollzellen. Die nach etwa 12 Stunden erfolgte Aufhebung des S- Phasenarrests könnte auf eine Reparatur der DNA-Schäden zurückgeführt werden. G1 S G/M Abbildung 31: Zellzyklusphasenverteilung nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m 2. Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m 2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde die Zellzyklusphasenverteilung am Durchflusszytometer ermittelt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen ± SD. Verschiedene Arbeiten in menschlichen Zellen zeigen, dass die Reparatur von 6-4-PP sehr schnell und effizient erfolgt, mit einer nahezu vollständigen Reparatur nach drei Stunden, wohingegen die Reparatur von CPDs selbst nach 24 Stunden nur 50 bis 80 % beträgt. (Ford und Hanawalt, 1997; Hwang et al., 1999; Riou et al., 2004). Während der DNA-Replikation in der S-Phase des Zellzyklus führen die verbleibenden Schäden zu einer Aktivierung des S- Phasenkontrollpunktes. Der erfolgte S-Phasenarrest und somit die Inhibierung der DNA- Synthese-Rate äußert sich sowohl auf der Ebene der Kettenverlängerung als auch auf Ebene der Replikon-Initiation der DNA-Synthese. Die replikativen DNA-Polymerasen ε und δ sind nicht in der Lage, an Photoprodukten vorbei zu replizieren, so dass eine translesion synthesis durch eine spezielle Polymerase η eingeleitet werden muss. Des Weiteren spielen auch Prozesse eine Rolle, in denen die Proteinkinase ATR, sowie die von ATR domnstream regulierte Kinase Chk1 (checkpoint kinase) involviert sind und zur Phosphorylierung von p53 führen (Heffernan et al., 2002). p53 kann dann Gene induzieren, deren Genprodukte den Fortgang des Zellzyklus kontrollieren. 52

59 Ergebnisse und Diskussion 5.3 Cadmium Im folgenden Teil dieser Arbeit werden vergleichende Untersuchungen zum Einfluss von löslichem CdCl 2 und partikulärem CdO auf die Zytotoxizität und die Induktion des Tumorsuppressorproteins p53 vorgestellt. Im Anschluss werden die Effekte der eingesetzten Cadmiumverbindungen auf die Struktur und die Funktion des p53-proteins näher betrachtet. Die Größenverteilung und das Agglomerationsverhalten der CdO-Partikel wurden mit dem Rasterelektronenmikroskop (LEO 1530) am Institut für Werkstoffe der Elektrotechnik der Universität Karlsruhe untersucht. Die Aufnahmen zeigen, dass die eingesetzten Partikel kleiner sind als 1 µm (Abbildung 32) und somit phagozytiert werden können. 10 µm 1 µm Abbildung 32: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der verwendeten CdO- Partikel Koloniebildung Zur Abschätzung der Zytotoxizität von CdCl 2 und CdO wurden A549 Zellen auf die beiden Endpunkte Zellzahl und Koloniebildungsfähigkeit nach einer 24 Stunden-Inkubation mit der jeweiligen Cadmiumverbindung untersucht. Werden die Ergebnisse von löslichem CdCl 2 und unlöslichem CdO miteinander verglichen, so zeigten 75 µm CdCl 2 und 1,5 µg CdO ähnliche zytotoxische Eigenschaften, mit einer Reduktion der Koloniebildungsfähigkeit auf etwa 50 % in Bezug zur unbehandelten Kontrolle. Während bei CdO im untersuchten Konzentrationsbereich die Zellzahl annähernd im gleichen Maße reduziert wurde wie die Koloniebildungsfähigkeit, war bei CdCl 2 die Koloniebildung der sensitivere Endpunkt im Vergleich zur Zellzahl. Während eine Inkubation 53

60 Ergebnisse und Diskussion mit 100 µm CdCl 2 die Zellzahl um 30 % erniedrigte, war die Koloniebildung bereits um 80 % des Ausgangswertes reduziert (Abbildung 33). Zellzahl Koloniebildungsfähigkeit A Zellzahl Koloniebildungsfähigkeit B Abbildung 33: Koloniebildungsfähigkeit und Zellzahl von A549 Zellen nach 24 h Inkubation mit CdCl 2 (A) und CdO (B). Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen ± SD. 54

61 Ergebnisse und Diskussion Induktion von p53 Das Protein p53 unterliegt aufgrund einer Ubiquitin vermittelten Degradation einem ständigen Auf- und Abbau in der Zelle. Die kurze Halbwertszeit von etwa 20 Minuten in ungestressten Zellen wird durch eine Stabilisierung infolge von DNA-Schäden erhöht. Ein möglicher Einfluss einer 24-Stunden-Inkubation mit CdCl 2 und CdO auf den p53- Proteingehalt wurde mittels Westernblot-Analyse untersucht. CdCl 2 [µm] A CdO [µg/cm²] 0 0 0,1 0,2 0,5 1 1,5 B Abbildung 34: Westernblot nach Inkubation mit CdCl 2 (A) und CdO (B). Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert und anschließend wurde ein Westernblot mit anti-p53-antikörper DO-7 aus dem Zelllysat durchgeführt. Dargestellt ist ein Westernblot. Insgesamt wurden drei unabhängige Versuche durchgeführt, die alle das gleiche Ergebnis auswiesen. Sowohl CdCl 2 als auch CdO resultierte in einer konzentrationsabhängigen Zunahme der Bandenintensität in A549 Zellen. Eine Inkubation mit CdCl 2 zeigte bereits ab 10 µm eine deutliche Steigerung des p53-proteingehaltes. Ab etwa 50 µm wurde eine Art Plateau erreicht und die Expression zeigte bis hin zu 75 µm einen maximalen Wert. Ebenso verstärkte CdO bereits bei geringen Konzentrationen von etwa 0,2 µg/cm 2 Wachstumsfläche der Zellen die Expression von p53, die bis hin zu 1,5 µg/cm 2 stetig anstieg (Abbildung 34). Ein Mechanismus der zu einem gesteigerten p53-proteingehalt führen könnte, wäre eine Induktion von oxidativen DNA-Schäden als Folge einer verstärkten Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) aufgrund einer Störung der zellulären Verteidigungsmechanismen 55

62 Ergebnisse und Diskussion (Stohs und Bagchi, 1995; Valko et al., 2005). Eine vermehrte Bildung von ROS, vermutlich in erster Linie Superoxidradikalanion und Wasserstoffperoxid wurde durch CdCl 2 in kultivierten menschlichen Lungenfibroblasten und Makrophagen nachgewiesen (Hassoun und Stohs, 1996; Yang et al., 1997). Dally und Hartwig (1997) konnten in Hela-Zellen eine Induktion von DNA-Strangbrüchen durch CdCl 2 nachweisen. Als ein weiterer Mechanismus zur Entstehung oxidativer DNA-Schäden wird neben der ROS-vermittelten Induktion, eine Hemmung der Reparatur von endogen-induzierten oxidativen DNA-Schäden diskutiert. So konnten Dally und Hartwig (1997) eine verminderte Reparatur von lichtinduzierten Fpgsensitiven Stellen durch CdCl 2 in HeLa-Zellen zeigen. Die beobachtete Hemmung der Basenexzisionsreparatur könnte auf einer Hemmung der Schadenserkennung durch spezielle Glykosylasen zurückzuführen sein. So zeigen neue Studien eine Herunterregulierung der Expression der menschlichen Ogg1 (8-Oxoguanin-Glykosylase) durch Cadmium (Potts et al., 2003; Youn et al., 2005). SP1, der Transkriptionsfaktor für Ogg1, besitzt einen Zinkfinger, so dass die Hemmung der Ogg1-Expression auf eine Beeinträchtigung des Zinkfingers zurückzuführen sein könnte (Youn et al., 2005) Immunpräzipitation Zur Untersuchung der Struktur von p53 wird eine Immunpräzipitation mit konformationsspezifischen Antikörpern durchgeführt. Die Struktur von p53 wird durch die Komplexierung eines Zink-Ions aufrechterhalten. Wird das Zink-Ion durch Metallchelatoren oder durch Oxidation der Zink-bindenden Cysteine aus dem Proteinmotiv entfernt, kommt es zu einer Konformationsänderung. Zwischen den beiden p53-formen, der gefalteten Wildtyp- Form und der ungefalteten mutanten Form, wurde mit konformationsspezifischen Antikörpern unterschieden. Der Antikörper PAb 1620 ist gegen ein konformationsabhängiges Epitop in der DNA-Bindungsdomäne gerichtet, das empfindlich gegenüber Denaturierung ist und somit die Wildtyp-Konformation erkennt. Im Gegensatz dazu bindet der Antikörper PAb 240 an ein Aminosäuremotiv, das in der Wildtyp-Form verborgen ist und erst bei der mutanten -Form durch Umfaltung des Proteins zum Vorschein kommt (Milner, 1995). Die Bezeichnung mutante Form resultiert aus der Tatsache, dass Mutationen, die zu einer Inaktivierung von p53 als Tumorsuppressorprotein führen einen gemeinsamen Effekt auf die Konformation des Proteins haben und das Protein folglich keine Reaktion mit dem Antikörper PAb 1620 zeigt, stattdessen aber eine Bindung des Antikörpers PAb 240 (Gannon et al., 1990). 56

63 Ergebnisse und Diskussion CdCl 2 [µm] Wildtyp-Konformation mutante Konformation A Wildtyp-Konformation mutante Konformation CdO [µg/cm²] 0 0,2 0,5 0, ,2 0,5 0,75 1 B Abbildung 35: Immunpräzipitation mit konformationsspezifischen Antikörpern gegen wildtyp- und mutante Konformation von p53 nach Inkubation mit CdCl 2 (A) und CdO (B). A549 Zellen wurden 24 h mit CdCl 2 inkubiert und anschließend wurde eine Immunpräzipitation vom p53 aus dem Zellysat mit entsprechenden Antikörpern gegen die Wildtyp- (PAb 1620) bzw. mutante Konformation (PAb 240) durchgeführt. Immunopräzipitiertes p53 wurde im Anschluss durch Westernbot-Analyse mit dem anti-p53- Antikörper CM-1 detektiert. Dargestellt ist ein Ergebnis von drei Versuchen. Die Effekte von CdCl 2 und CdO auf die Konformation des p53 Proteins werden in Abbildung 35 gezeigt. Dargestellt sind jeweils nur die spezifischen Banden der resultierten Blots. Generell wiesen die Blots unspezifische Banden auf, die allerdings auch dann auftraten, wenn an Stelle des Zelllysats nur Immunpräzipitationspuffer für die Immunpräzipitation verwendet wurde. Diese Artefakte lassen sich vermutlich auf die Verwendung von Protein A/G zurückführen. IgGs binden unabhängig von der Antigenspezifität durch den FC-Teil an Proteine A/G, somit kann der sekundäre Antikörper sowohl spezifisch an p53 als auch unspezifisch an Protein A/G binden. Beide Verbindungen zeigten eine deutliche konzentrationsabhängige Induktion der ungefalteten mutanten -Form des Proteins, während die gefaltete Wildtyp-Form nahezu unverändert war. CdCl 2 führte bereits bei einer Konzentration von 10 µm zu einer schwachen Bildung der mutanten Konformation. Eine starke Bildung der mutanten Konformation war ab Konzentrationen von 50 µm bis hin zu 75 µm zu sehen. Ebenso resultierte die 57

64 Ergebnisse und Diskussion Behandlung mit CdO schon bei 0,2 µg/cm 2 Wachstumsfläche in einer Denaturierung von p53, die konzentrationsabhängig bis hin zu 1 µg/cm 2 verstärkt wurde. Die mittels Westernblot in Kapitel gezeigte Induktion von p53 infolge der Inkubation mit der jeweiligen Cadmiumverbindung scheint also vielmehr auf einer Umwandlung in die mutante Form als auf einer Induktion der Wildtyp-Form zu beruhen. Die mutante Form besitzt eine mit 5 bis 10 Stunden deutlich längere Halbwertszeit als die Wildtyp-Form mit maximal 20 Minuten (Soussi, 2000). Dadurch führt eine Umwandlung in die mutante Form zu einer Akkumulation von p53. Ob Cadmium allerdings dennoch in der Lage ist, p53-wildtyp zu induzieren (infolge eventuell gebildeter oxidativer DNA-Schäden) und diese Wildtyp-Form dann direkt in die mutante Form umgewandelt wird, bedarf noch weiterer Klärung. Während frühere Studien für das lösliche CdCl 2 bereits eine Umwandlung der Wildtyp-Form in die mutante Form zeigen konnten (Hainaut und Milner, 1993b; Meplan et al., 1999), wurde in der hier vorliegenden Arbeit erstmalig eine Konformationsänderung für das unlösliche partikuläre CdO nachgewiesen Genexpression von p21, p48 und XPC Um zu untersuchen inwieweit die Cadmium-vermittelte Strukturveränderung von p53 einen Einfluss auf die Expression seiner Zielgene hat, wurde die Genexpression verschiedener, durch p53 regulierter Gene mittels Real Time RT-PCR untersucht p21 In Abbildung 36 ist die Genexpression von p21 in Abhängigkeit von der inkubierten Cadmiumkonzentration gezeigt. Die Ergebnisse sind jeweils relativ zu der auf 1 normierten Kontrolle dargestellt. Mit steigender Konzentration führte die Inkubation zu einer Zunahme der Genexpression. Die Induktion durch CdCl 2 war bereit ab 10 µm deutlich zu erkennen. Die Werte stiegen bis hin zu 50 µm linear an, bis sich ab etwa 50 µm eine Art Plateau einstellte, nach dem mit steigender Konzentration keine weitere Erhöhung erzielt werden konnte. Im Gegensatz dazu resultierte die Behandlung mit CdO in einer allmählichen Induktion der Genexpression, die insgesamt schwächer ausgeprägt war als bei CdCl 2. 58

65 Ergebnisse und Diskussion A B Abbildung 36: Relative Genexpression von p21 nach Inkubation mit CdCl 2 (A) und CdO (B) Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert und anschließend wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p21 relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD. 59

66 Ergebnisse und Diskussion p48 Versuche zum Einfluss der jeweiligen Cadmiumverbindungen auf den basalen mrna Gehalt von p48 zeigten eine Hemmung der Genexpression mit steigender Cadmiumkonzentration (Abbildung 37). A B Abbildung 37: Relative Genexpression von p48 nach Inkubation mit CdCl 2 (A) und CdO (B). Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert und anschließend wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p48 relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD. 60

67 Ergebnisse und Diskussion CdCl 2 reduzierte konzentrationsabhängig den mrna Gehalt in A549 Zellen ab 50 µm und erreichte bei 75 µm nur noch etwa 50 % des Ausgangswertes. Eine Inkubation mit CdO resultierte ebenfalls in einer Abnahme der Genexpression, wenn auch nicht so stark ausgeprägt wie bei CdCl XPC In Abbildung 38 ist der Einfluss von CdCl 2 und CdO auf die basale Genexpression von XPC dargestellt. Die Kontrolle wurde auf 1 normiert und alle gezeigten Werte relativ zur unbehandelten Kontrolle errechnet. A B Abbildung 38: Relative Genexpression von XPC nach Inkubation mit CdCl 2 (A) und CdO (B). Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert und anschließend wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von XPC relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD. 61

68 Ergebnisse und Diskussion Sowohl CdCl 2 als auch CdO zeigten im untersuchten Konzentrationsbereich einen nur schwach ausgeprägten Effekt auf die relative Genexpression von XPC. In wieweit sich allerdings selbst kleinste Änderungen im mrna Gehalt auf den für die Wirkung in der Zelle ausschlaggebende Proteinmenge auswirkt, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden. 62

69 Ergebnisse und Diskussion 5.4 Kombinationsuntersuchungen Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte Zytotoxizität Der Effekt der jeweiligen Cadmiumverbindung auf die UVC-induzierte Zytotoxizität wurde anhand der Koloniebildungsfähigkeit nach 24 h Vorinkubation mit CdCl 2 bzw. CdO im Anschluss an eine Bestrahlung mit einer nicht zytotoxischen Dosis von 5 J/m 2 UVC- Strahlung konzentrationsabhängig untersucht. CdCl 2 UVC 5J/m 2 + CdCl 2 A CdCl 2 UVC 5J/m 2 + CdCl 2 B Abbildung 39: Einfluss von CdCl 2 (A) und CdO (B) auf die UVC-induzierte Zytotoxizität. Die jeweiligen Werte bei den entsprechenden Cadmiumkonzentrationen sind normiert auf unbehandelte Zellen für alleinige Cadmium-Inkubation bzw. auf UVC behandelte Zellen für UVC + Cadmium. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmung +SD. 63

70 Ergebnisse und Diskussion Beide Verbindungen zeigten keine deutliche Verstärkung der zytotoxischen Eigenschaft von UVC-Strahlung (Abbildung 39). Eine mögliche durch Cadmium verursachte Reparaturhemmung UVC-induzierter Schäden muss allerdings nicht zwangsläufig in einem Replikationsstopp und somit in einer Abnahme der Überlebensrate resultieren. Nicht reparierte DNA-Addukte können über so genannte TLS (translesion synthesis) durch die Polymerase η entfernt werden Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte p53 Induktion Wie in Kapitel gezeigt werden konnte, führte eine UVC-Behandlung zu einer Zunahme des p53 Gehalts mit einem Maximalwert drei Stunden nach der Bestrahlung. Der Effekt von Cadmium auf den basalen Level von p53 wurde in Kapitel beschrieben. Beide untersuchten Verbindungen führten zu einer Denaturierung der Wildtyp-Form von p53 und induzierten dadurch die Bildung der mutanten Konformation. Zur Untersuchung des Einflusses von Cadmium auf das durch UVC-Strahlung induzierte p53 Protein, wurden Kombinationsuntersuchungen durchgeführt. Hierzu wurden A549 Zellen 24 Stunden mit der jeweiligen Cadmiumverbindungen vorinkubiert, anschließend mit 5 J/m 2 UVC bestrahlt und im Anschluss nach drei Stunden Nachinkubation mit Cadmium die Konformation des resultierenden p53 Proteins mittels Immunpräzipitation bestimmt. In Abbildung 40 sind zunächst die Effekte einer alleinigen Behandlung mit UVC bzw. mit der jeweiligen Cadmiumverbindung dargestellt. Des Weiteren ist der Einfluss einer Co- Inkubation auf die p53 Konformation gezeigt. Es konnte zunächst beobachtet werden, dass es sich bei der in Abschnitt gezeigten Induktion von p53 infolge der UVC-Bestrahlung um eine Zunahme des Gehalts der Wildtyp-Form handelte und nicht um eine Stabilisierung aufgrund einer Bildung der mutanten Konformation. Die Kombinationsversuche zeigten, dass beide Verbindungen zu einer Abnahme der Wildtyp-Konformation im Vergleich zu UVC behandelten Zellen führten. Hierbei war der Effekt bei CdCl 2 stärker ausgeprägt als bei CdO. Allerdings führte eine Co-Inkubation sowohl mit CdCl 2 als auch mit CdO zu einer Zunahme der mutanten Konformation, die eine längere Halbwertszeit besitzt. Ob dennoch eine UV-induzierte p53 Induktion stattfindet, gebildetes p53 dann allerdings durch die jeweilige Cadmiumverbindung sofort in die mutante Form überführt wird, oder ob eventuell sogar die Induktion der Wildtyp-Konformation gehemmt wird, indem Cadmium in die Signalkaskade eingreift, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht geklärt werden. 64

71 Ergebnisse und Diskussion A wildtyp-konformation mutante Konformation Ko CdCl 2 UV UV CdCl 2 + UV CdCl 2 + UV Ko CdCl 2 UV UV CdCl 2 + UV CdCl 2 + UV B wildtyp-konformation mutante Konformation Ko CdO UV UV CdO + UV CdO + UV Ko CdO UV UV CdO + UV CdO + UV Abbildung 40: Einfluss von 60 µm CdCl 2 (A) und 1,0 µg/cm 2 CdO (B) auf die UVCinduzierte p53 Induktion. A549 Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung vorinkubiert, anschließend wurde mit 5 J/m 2 UVC bestrahlt und nach 3 Stunden Nachinkubation wurde eine Immunpräzipitation aus dem Zellysat mit entsprechenden Antikörpern gegen die Wildtyp- (PAb 1620) bzw. mutante Konformation (PAb 240) durchgeführt. Immunopräzipitiertes p53 wurde im Anschluss durch Westernbot-Analyse mit dem anti-p53-antikörper CM-1 detektiert. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von drei Versuchen Genexpression von p21, p48 und XPC Der Einfluss der Cadmiumverbindungen auf die UVC-induzierte Genexpression der p53 Zielgene p21, p48 und XPC wurde nach 24 Stunden Vorinkubation untersucht. Da für die drei betrachteten Gene die Induktion infolge der UVC Bestrahlung zwischen 6 und 10 Stunden nach der Bestrahlung maximal ist, wurde für die Kombinationsuntersuchungen die Genexpression 10 Stunden nach der UVC Behandlung mittels Real Time RT PCR untersucht p21 In Abbildung 41 ist der Einfluss von Cadmium auf die durch UVC-Strahlung induzierte p21 Genexpression dargestellt. Zunächst ist erneut der in Kapitel beschriebene Effekt einer alleinigen UVC-Bestrahlung 10 Stunden nach der Behandlung gezeigt. Die Bestrahlung resultierte in einer etwa fünffachen Zunahme der Genexpression im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle. Eine Inkubation mit der jeweiligen Cadmiumverbindung erreichte 65

72 Ergebnisse und Diskussion dagegen nur mrna-gehalte von etwa doppeltem Gehalt bei 60 und 75 µm CdCl 2 (Abbildung 41 A) bzw. dreifachen bei 1,0 und 1,5 µg/cm 2 CdO (Abbildung 41 B). A B Abbildung 41: Auswirkung von CdCl 2 (A) und CdO (B) auf die UVC-induzierte p21 Genexpression. Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung vorinkubiert, anschließend wurde mit 5 J/m 2 UVC bestrahlt und in Gegenwart von Cadmium 10 h nachinkubiert. Im Anschluss wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p21 relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD. 66

73 Ergebnisse und Diskussion p48 Die UVC-Bestrahlung mit 5 J/m 2 verursachte eine zeitabhängige Steigerung der Genexpression von p48 mit einer mehr als doppelten mrna-menge im Vergleich zu unbestrahlten Zellen nach etwa 10 bis 12 Stunden (Kapitel ). A B Abbildung 42: Auswirkung von CdCl 2 (A) und CdO (B) auf die UVC-induzierte p48 Genexpression. Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert, anschließend wurde mit 5 J/m 2 UVC bestrahlt und in Gegenwart von Cadmium 10 h nachinkubiert. Im Anschluss wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p48 relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD. 67

74 Ergebnisse und Diskussion Inwieweit dieser Effekt durch eine Vorinkubation mit der jeweiligen Cadmiumverbindung beeinflusst wird, ist in Abbildung 42 dargestellt. Sowohl CdCl 2 als auch CdO führten zu einer konzentrationsabhängigen Abnahme der durch alleinige UVC-Bestrahlung nach 10 Stunden induzierten mrna-menge XPC Eine UVC-Bestrahlung mit 5 J/m 2 führte wie in Kapitel gezeigt zu einer zeitabhängigen Induktion der XPC Genexpression mit einer maximalen Induktion 12 Stunden nach der Bestrahlung. A B Abbildung 43: Auswirkung von CdCl 2 (A) und CdO (B) auf die UVC-induzierte XPC Genexpression. Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung vorinkubiert, anschließend mit 5 J/m 2 UVC bestrahlt und in Gegenwart von Cadmium 10 h nachinkubiert. Im Anschluss wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von XPC relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD. 68

75 Ergebnisse und Diskussion 10 Stunden nach der Bestrahlung wies die Genexpression noch den 2fachen Wert der unbehandelten Kontrolle auf. Wie in Abbildung 43 zu sehen, führte sowohl CdCl 2 als auch CdO zu einer Abnahme der durch alleinige UVC-Bestrahlung nach 10 Stunden induzierten mrna-menge. Eine Beeinflussung der UVC-induzierten Genexpression der Zielgene von p53 durch Cadmiumverbindungen konnte in der vorliegenden Arbeit erstmalig gezeigt werden. Die verminderte Induktion ist möglicherweise auf verschiedene Mechanismen zurückzuführen. Zum einen könnte die Induktion des Transkriptionsfaktors p53 dennoch stattfinden, die induzierte Wildtyp-Form aber direkt durch Cadmium in die mutante Form umgewandelt werden und somit nicht mehr die Transkription der Zielgene einleiten. Zum anderen wäre eine Beeinflussung der Wildtyp-Form durch die mutante Form denkbar. p53 bindet in seiner aktiven Form als Tetramer an bestimmte Bereiche seiner Zielgene und löst in diesem Zustand deren Transkription aus. Durch eine Bildung von gemischten Tetramere aus Wildtyp- und mutanter Form könnte es somit ebenfalls zu einer Inhibierung der Funktion des Transkriptionsfaktors kommen. Denkbar wäre auch eine verminderte Induktion von p53 aufgrund von Störungen der Signalkaskade und somit einer Störung der Stabilisierung des p53 Proteins Zellzyklusphasenverteilung In Tabelle 6 ist sowohl der Effekt von CdCl 2 als auch die Auswirkung von CdO in Kombination mit UVC auf die Zellzyklusphasenverteilung in A549 Zellen dargestellt. CdCl 2 führt zu einer leichten Zunahme des Anteils der Zellen in der G1-Phase (von 63,9 % G1- Phase in unbehandelten Zellen auf 70,4 % nach einer Inkubation mit 75 µm CdCl 2 ). Wie bereits in Kapitel gezeigt, führt eine Bestrahlung mit 5 J/m 2 UVC zu einer Akkumulation der Zellen in der S-Phase 10 Stunden nach Bestrahlung (von 25,6 % S-Phase in unbehandelten Zellen auf 46,1 % nach UVC-Bestrahlung). Dieser durch UVC-Strahlung verursachte S-Phasenarrest wird durch die Vorinkubation mit CdCl 2 nahezu vollständig aufgehoben. So befinden sich 10 Stunden nach der Bestrahlung bei einer vorherigen Inkubation mit 75 µm CdCl 2 für 24 Stunden nur noch 28,8 % der Zellen in der S-Phase. Die Verteilung entspricht damit nahezu der von unbehandelten Zellen. Ein ähnliches Resultat zeigte auch die Behandlung mit CdO. Auch hier führte CdO zu einer leichten Steigerung des Anteils der Zellen in der G1-Phase (von 66,9 % G1-Phase in unbehandelten Zellen auf 70,7 % 69

76 Ergebnisse und Diskussion nach einer Inkubation mit 1,5 µg/cm 2 ), während eine Vorinkubation mit CdO den durch UVC-Strahlung hervorgerufenen S-Phasenarrest aufhob (von 24,1 % S-Phase in bestrahlten Zellen auf 22,1 % nach vorheriger Inkubation mit 1,5 µg/cm 2 CdO). Tabelle 6: Auswirkung von CdCl 2 (A) und CdO (B) auf die Zellzyklusphasenverteilung 10 Stunden nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m 2. Dargestellt sind die prozentualen Anteile der Zellen in der jeweiligen Zellzyklusphase ± SD. Phase A 0 µm CdCl 2 60 µm CdCl 2 75 µm CdCl 2 - UV + UV - UV + UV - UV + UV G1 63,9 ± 3,2 44,7 ± 2,0 69,2 ± 2,3 58,8 ± 3,6 70,4 ± 2,5 65,6 ± 2,5 S 25,6 ± 2,1 46,1 ± 3,9 22,0 ± 1,7 35,2 ± 2,8 22,3 ± 1,2 28,8 ± 1,2 G2/M 10,4 ± 1,8 99,2 ± 5,1 98,4 ± 1,1 95,9 ± 1,2 97,4 ± 1,8 95,6 ± 1,8 Phase B 0 µg/cm 2 CdO 1,0 µg/cm 2 CdO 1,5 µg/cm 2 CdO - UV + UV - UV + UV - UV + UV G1 66,9 ± 3,2 48,1 ± 1,4 69,1 ± 2,1 57,5 ± 1,4 70,7 ± 5,3 62,1 ± 5,8 S 24,1 ± 1,6 46,9 ± 1,2 22,6 ± 1,0 37,9 ± 2,4 22,1 ± 3,2 33,7 ± 5,5 G2/M 99,0 ± 1,8 95,0 ± 0,4 98,4 ± 1,3 94,6 ± 1,0 97,2 ± 2,1 94,2 ± 0,4 70

77 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick 6 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick UVC-Strahlung führt zu helixverzerrenden DNA-Addukten, die über eine Zellzyklusphasenunabhängige NER entfernt werden. Um ein größeres Zeitfenster für die Reparatur zu gewährleisten, existieren verschiedene Kontrollpunkte im Zellzyklus. Diese verzögern z.b. beim G1-Phasen-Kontrollpunkt den Übergang von der G1-Phase zur S-Phase. Die Regulation des G1-Phasen-Kontrollpunktes wird u.a. über das Protein p21 gesteuert, indem es an Cyclin- CDK-Komplexe bindet und diese so in ihrer Aktivität inhibiert. CDKs (Cyclin dependent kinase) sind für die Progression im Zellzyklus unentbehrlich und eine Inhibierung resultiert folglich in einem Stillstand des Zellzyklus. Dennoch unerkannte Schäden oder Schäden die sich erst in der darauf folgenden S-Phase ereignen, führen während der Replikation zu einem Stopp der Polymerase an dem DNA-Addukt, was eine Verlangsamung der Replikation zur Folge hat und somit in einem S-Phasenarrest resultiert. Über den Mechanismus des S- Phasenarrestes ist wenig bekannt. Denkbar wäre, dass p21 auch hier eine Rolle spielt. Es ist bekannt, dass p21 an PCNA bindet (Waga und Stillman, 1998). Dies hat eine Unterdrückung der Aktivität der Polymerase δ zur Folge und führt somit zu einer Hemmung der Replikation (S-Phasenarrest). Neben den normalen für die DNA-Replikation verantwortlichen Polymerasen, existieren noch weitere Polymerasen, die für die Replikation von DNA- Addukten verantwortlich sind. Die Polymerase κ repliziert beispielsweise BPDE-induzierte DNA-Addukte und ist somit auch für den Fortgang des Zellzyklusses nach dem durch BPDE induzierten S-Phasenarrestes verantwortlich (Bi et al., 2005), während die Polymerase η den Bypass von UV-induzierten Photoprodukten übernimmt (Goodman, 2002; Kannouche et al., 2001; Kannouche und Stary, 2003). Mutationen des verantwortlichen Gens XPV führen zu der UV-sensitiven Erbkrankheit Xeroderma Pigmentosum-V (XPV) (Friedberg, 2001; Tuteja und Tuteja, 2001). Die infolge der UVC-Bestrahlung resultierende Steigerung der Genexpression von p21 in A549 Zellen korreliert zeitlich sehr gut mit dem gesteigerten Proteingehalt von p53. Die Expression von p48 und XPC, deren Genprodukte in der Schadenserkennung der NER involviert sind, werden ebenfalls durch p53 reguliert. Adimoolam und Ford (2002) und Tan und Chu (2002) konnten p53 responsive Elemente in den jeweiligen Genen identifizieren. Die Versuche zeigen einen zeitabhängigen Anstieg infolge von UVC-Strahlung, allerdings ist die maximale Induktion zu späteren Zeitpunkten verschoben als die p53-induktion. Eine 71

78 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick gesteigerte Expression findet allerdings bereits drei Stunden nach der Bestrahlung statt und spiegelt sich somit in der Zeitachse der p53-induktion wider. Warum allerdings die maximale Zunahme zu späteren Zeitpunkten verschoben ist, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden. Denkbar ist eine Zwischenschaltung weiterer regulierender Mechanismen, die letztendlich zur Einleitung der Transkription von p48 und XPC führen. Kinetikversuche zur Bindung von p53 an die jeweiligen responsiven Elemente der Zielgene könnten Aufschluss über die Ereignisse zwischen maximaler p53-protein-induktion und maximaler Induktion seiner Zielgene geben. UVC-Strahlung führt 10 Stunden nach der Bestrahlung zu einer Ansammlung von Zellen in der S-Phase des Zellzyklusses, was auf einen stattfindenden S-Phasenarrest durch gestörte DNA-Replikation von zuvor nicht reparierten DNA-Schäden hinweist. Zeitlich korreliert die gesteigerte p21-expression gut mit dem erhaltenen S-Phasenarrest, so dass hier evtl. ein Zusammenhang bestehen könnte. Ob die drei Stunden nach der Bestrahlung bereits erhöhte p21 Expression zuvor in einen G1-Arrest resultiert, dieser allerdings durch eine schnelle Reparatur wieder aufgehoben wird und somit in dem zwischen 3 und 6 Stunden nicht gemessenen Zeitfenster unerfasst bleibt, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden. Schäden, die sich im Chromatin ereignen und somit nicht erkannt wurden, führen erst während der Replikation zu einem Stillstand des Zellzyklusses und resultieren in einem S- Phasenarrest bis die Schäden repariert sind. Die gesteigerte Expression der DNA- Reparaturgene p48 und XPC 10 Stunden nach der Bestrahlung unterstützt die These, dass der resultierende S-Phasenarrest eingeleitet wird, um Zeit zur Reparatur zu gewährleisten. Die Abnahme der Expression der Reparaturgene sowie der Rückgang der Expression von p21 korrelieren zeitlich sehr gut mit der Aufhebung und somit Fortgang des Zellzyklusses, was auf eine erfolgte Reparatur schließen lässt. Ergebnisse der letzten Jahre haben gezeigt, dass so genannte Zinkfingerstrukturen, in denen ein Zink-Ion an jeweils festgelegte Cystein- und/oder Histidinreste bindet, um die Struktur einer kleinen, autonom gefalteten Proteindomäne zu stabilisieren, empfindliche Angriffspunkte für toxische Metallverbindungen sind (Abbildung 44). Cadmium(II) besitzt aufgrund seiner Größe, seiner kleinen positiven Ladungsdichte und seiner ungepaarten Elektronen eine leichten Polarisierbarkeit und somit die Eigenschaft eines weichen Ions. Es fungiert als Elektronenpaarakzeptor (Lewis-Säure) und kann nach der Lewis-Säure-Base- Theorie mit einer weichen Base reagieren. Als weiche Base können in Proteinen der 72

79 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick Stickstoff aus Imidazolen (z.b. Histidin) und der Schwefel aus Thiolen (z.b. Cystein) fungieren (Glusker, 1991). Cd(II) könnte somit in der Lage sein, Zink aus der Zink-bindenden Domäne von Zinkfingerproteinen zu verdrängen, zumal es durch seine analoge Elektronenkonfiguration eine ähnliche chemische Reaktivität aufweist. Abbildung 44: Mögliche Wechselwirkung von Metallverbindungen mit Zink-bindenden Strukturen (Hartwig, 2001). Das Tumorsuppressorprotein p53 wird zwar trotz seiner Zink-bindenden Domäne nicht zu den Zinkfingerproteinen gezählt, da es keine fingerähnliche Struktur ausbildet (Hainaut und Mann, 2001), dennoch ist die Komplexierung eines Zink-Ions durch 3 Cysteinreste und einem Histidinrest essenziell für die Aufrechterhaltung der Struktur der DNA-bindenden Domäne und somit auch für seine Funktion als Transkriptionsfaktor. Wie bereits Versuche mit Metallchelatoren (Hainaut und Milner, 1993b; Verhaegh et al., 1998) und Oxidationen der Cysteine mit Diamid (Hainaut und Milner, 1993a) zeigen konnten, kommt es durch eine Herauslösung des Zink-Ions aus der Struktur von p53 zu einer Auffaltung des Proteins was einen Verlust der DNA-Bindungsfähigkeit zur Folge hat. Die Fähigkeit von löslichen Cadmiumverbindungen, die Konformation von p53 zu beeinflussen und somit zur Bildung der mutanten Konformation zu führen, zeigen bereits frühere Studien mit CdSO 4 und CdCl 2 (Hainaut und Milner, 1993b; Meplan et al., 1999). Dass allerdings partikuläres CdO ebenfalls 73

80 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick in der Lage ist, eine Konformationsänderung von p53 Wildtyp hervorzurufen wurde in dieser Arbeit erstmalig untersucht. Des Weiteren zeigten bisher keine Studien, dass Cadmiumverbindungen einen Einfluss auf die basale Expression der p53-zielgene p48 und XPC haben und folglich in die DNA-Reparatur eingreifen könnten. Eine Inkubation mit der jeweiligen Cadmiumverbindung reduziert die Genexpression von p48 und XPC. Dies könnte auf die Bildung der mutanten Form infolge einer Bindung von Cadmium-Ionen an p53 im Austausch von Zink zurückzuführen sein. So zeigt sowohl CdCl 2 als auch CdO eine konzentrationsabhängige Bildung der mutanten Form von p53. Aufgrund der längeren Halbwertszeit von 5 bis 10 Stunden der mutanten Form im Vergleich zu maximal 20 Minuten der Wildtyp-Form (Soussi, 2000), beruht der durch Westernblot- Analyse gezeigte gesteigerte Gesamtgehalt von p53 infolge der Cadmium-Inkubation vermutlich auf der Bildung und Akkumulation der stabilen mutanten Konformation und nicht auf einer Stabilisierung der Wildtyp-Form. Da die Bindung von p53 an die DNA seiner Zielgene als Tetramer erfolgt und so deren Expression ausgelöst wird, kann die Entstehung der mutanten, nicht zur DNA-Bindung fähigen Form, dazu führen, dass gemischte Heterotetramere aus Wildtyp- und mutanter -Form gebildet werden, die dann nicht mehr als Transkriptionsfaktor wirken können (dominant negativer Effekt) (Kern et al., 1992; Cadwell und Zambetti, 2001). Dies wäre eine Erklärung dafür, dass trotz eines annähernd konstanten p53-wildtyp-gehaltes eine Beeinflussung nachgeschalteter Mechanismen stattfindet. Oxidative DNA-Schäden infolge einer durch Cadmium indirekt verursachten Zunahme an ROS könnten zu einer Stabilisierung von p53 führen. Andererseits könnte oxidativer Stress ebenfalls durch Oxidation von Cysteinen in der DNA-Bindungsdomäne zu einer Inaktivierung von p53 führen. So zeigen Arbeiten in menschlichen Zellen, exponiert mit NO, H 2 O 2 und Glutathion-depletierenden Agenzien eine durch Umfaltung verminderte DNA- Bindungsfähigkeit (Calmels et al., 1997; Parks et al., 1997; Russo et al., 1995). Allerdings unterliegt der Redoxstatus der p53 Wildtyp-Form in der Zelle einer Regulation über Thioredoxin bzw. Thioredoxin-Reduktase und Ref-1 (Redoxfaktor 1) und ist somit gut kontrolliert (Hainaut und Mann, 2001). Daher scheint es wahrscheinlicher, dass die Umfaltung auf den Austausch des Zink-Ions in der DNA-bindenden Domäne von p53 zurückzuführen ist. Cadmium besitzt einen größeren Atomradius als Zink (Cd: 0,97 Å; Zn: 0,74 Å) und könnte somit die Tertiärstruktur von p53 beeinflussen. Denkbar wäre auch eine Beeinflussung der Zink-Bindung in p53 durch Methallothioneine (MT). 74

81 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick Methallothioneine sind niedermolekulare Proteine, die aufgrund ihres hohen Cysteinanteils eine hohe Affinität zu essenziellen Metall-Ionen wie Zn(II), aber auch zu toxischen Metall- Ionen wie Cd(II) besitzen und somit deren intrazelluläre Verfügbarkeit regulieren. So zeigte eine Co-Transfektion von p53 und MT in p53 defizienten Zellen, dass die Überexpression von MT relativ zur p53-expression zu einer Hemmung der Transaktivierung von p53 führt. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass MT als ein Regulator der Zink-Bindung von p53 fungiert. Bei hohen Gehalten an MT wirkt es als Chelator und führt somit zur Herauslösung von Zn(II) aus p53 und damit zu dessen Inaktivierung (Hainaut und Mann, 2001). Da Cd(II) die MT-Expression induziert, könnte sich dies direkt negativ auf p53 auswirken. Eine dennoch durch die jeweilige Cadmiumverbindung erfolge Induktion von p21 könnte auf p53-unabhängigen Mechanismen beruhen. So zeigen zum einen Ergebnisse von Russo et al. (1995) eine p53 unabhängige Aktivierung der p21 Expression infolge von oxidativem Stress, zum anderen berichten Haapajarvi et al. (1999) von einer gesteigerte p21 Expression infolge einer UVC-Bestrahlung durch den Transkriptionsfaktor SP1. Der durch alleinige Cadmium- Inkubation hervorgerufene G1-Arrest könnte durch p21 hervorgerufen werden. Noch deutlicher sind die Effekte einer vermehrten Bildung der mutanten Form von p53 infolge einer Inkubation mit den jeweiligen Cadmiumverbindungen bei Kombinationsuntersuchungen mit UVC-Strahlung. Während UVC alleine zu einer Induktion der Zielgene p48, XPC und p21 führt, hat die Vorinkubation mit den jeweiligen Cadmiumverbindungen eine Hemmung der UVC-induzierten Expression zur Folge. Die Effekte von CdCl 2 sind hierbei etwas stärker als die von CdO. Dies lässt sich möglicherweise auf den ebenfalls bei CdCl 2 stärkeren Effekt auf die Hemmung der p53-wildtyp-induktion durch UVC-Strahlung zurückführen. Während CdCl 2 die Induktion von p53 vollständig hemmt und p53 in die mutante Konformation umgewandelt wird, führt eine Vorinkubation mit CdO noch zu einer leichten Erhöhung des UVC-induzierten p53-wildtyp-gehalts. Ob die jeweiligen Cadmiumverbindungen allerdings schon in die Signalkaskade zur Stabilisierung von p53 eingreifen und somit die Induktion durch UVC verhindert wird, oder ob die Induktion zunächst stattfindet, induziertes p53 dann allerdings durch Cadmium in die mutante Form umgewandelt wird, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht geklärt werden. Die Kombinationsversuche zur Koloniebildungsfähigkeit zeigen keine deutliche Verstärkung der UVC-induzierten Zytotoxizität. Diese Ergebnisse sind im Einklang mit Versuchen von 75

82 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick Tang et al. (2000) in Hamsterzellen, die aufgrund von Methylierungen des DDB2-Gens eine verminderte p48 Expression aufweisen. Es konnte gezeigt werden, dass die Transfektion von Hamsterzellen mit menschlichen p48 keinen Einfluss auf die Überlebensfähigkeit infolge einer UV-Bestrahlung hat. Allerdings zeigten diese Versuche, dass die Mutationsrate im nicht-transkribierten Strang in p48 transfizierten Zellen deutlich geringer ist. Der Effekt von p48 auf die UV-induzierte Mutationsrate ist bei nicht-tt-cpds größer als bei TT-CPDs. Dieser Befund könnte auf die Fähigkeit der Polymerase η, Photoprodukte zu replizieren, zurückzuführen sein. Diese hat die Eigenschaft Adenin gegenüber Photoprodukte einzubauen, so dass TT-CPDs effizient und mit großer Genauigkeit über translesion synthesis (TLS) repariert werden können, während nicht-tt-cpds durch falschen Einbau einer Adenin-Base zu Mutationen führen können. Vorhandene Addukte resultieren somit nicht zwangsläufig in einem Stopp der DNA-Polymerase, so dass die Überlebensrate unbeeinflusst bleibt. Eine Reparaturhemmung infolge eines geringeren p48 und oder XPC-Gehalts kann also möglicherweise zur fehlerbehafteten post-replicativen Reparatur führen, zumal die Polymerase η ebenfalls einen Zinkfinger aufweist und somit möglicherweise auch durch Cadmium gehemmt werden könnte. Hartwig und Beyersmann (1989) berichteten bereits von einer Erhöhung der durch UVC-Strahlung induzierten Mutationsrate durch Cadmium in chinesischen Hamsterzellen. Ob die Behandlung mit Cadmium allerdings in Kombination mit UVC-Strahlung die Mutationsrate in den in dieser Arbeit eingesetzten humanen Lungenadenokarzinomzelllinie erhöht, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden und müsste mit in einem Mutationstest näher untersucht werden. Des Weiteren führt eine Co-Behandlung mit den eingesetzten Cadmiumverbindungen zu einer Hemmung des durch UVC-Behandlung resultierenden S-Phasenarrests, was möglicherweise auf einer Hemmung der UVC-induzierten p21-expression zurückgeführt werden könnte. Allgemein muss berücksichtigt werden, dass es bei den hier vorgestellten Ergebnissen nur um die Expression der betrachteten Gene auf mrna-ebene handelt. Ob und in wieweit sich die erhaltenden Ergebnisse auf die Proteingehalte auswirken, müsste in weiteren Versuchen überprüft werden. Bei der Allgemeinbevölkerung liegen die Cadmiumkonzentrationen in der Lunge bei etwa 1,3 mg/kg Trockengewicht (Kollmeier et al., 1990). Mit dem in Kollmeier (1985) angegebenen Umrechnungsfaktor von Trockengewicht auf Nassgewicht für Lungengeweben ergeben sich Gehalte von ca. 0,3 mg/kg Nassgewicht in der Lunge. Ausgehend von einer 100 %igen Löslichkeit der Partikel in 9 ml Zellkulturmedium bei einer Schalengröße von 76

83 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick 60 cm 2 Wachstumsfläche, würde der eingesetzte Konzentrationsbereich von 0,1 bis 1,5 µg/cm 2 etwa im Bereich von 0,6 bis 10 µg Cadmium/ml liegen und somit etwa dem von 10 µm bis 75 µm eingesetzten Bereich von löslichem CdCl 2 entsprechen (1,1 bis 8,4 µg/ml). Dadurch wird deutlich, dass die eingesetzten Konzentrationen durchaus im physiologisch relevanten Bereich liegen, zumal die Gehalte bei Arbeitern der metallverarbeitenden Industrie um ein vielfaches höher liegen können und in Geweben wie der Niere und der Leber, in denen es zu einer Akkumulation des Metalls sogar Gehalte von bis zu 3 mg/kg bzw. 50 mg/kg Nassgewicht erreicht werden. Die Interpretation der Ergebnisse mit partikulären CdO ist allerdings schwierig, da CdO nahezu unlöslich in wässrigen Lösungen ist und die Partikel über Phagozytose in die Zelle gelangen. Während bei löslichen Verbindungen von einer homogenen Aufnahme über die Zellpopulation ausgegangen werden kann, werden in Versuchen mit unlöslichen partikulären Substanzen die Effekte als Summenparameter gemessen. Die Ergebnisse repräsentieren somit einen Mittelwert der Effekte von Zellen, die Partikel durch Phagozytose aufgenommen haben und Zellen, die nicht phagozytiert haben. Daher können die lokal auftretenden Effekte durch CdO weitaus stärker sein als die vorgestellten Mittelwerte. Die hohen Konzentrationen in der Niere resultieren aus der Induktion von MT durch Cadmium. Die Bindung von Cadmium an MT resultiert in Halbwertszeiten von bis zu 30 Jahren. Durch die Eigenschaft, toxische Metall-Ionen zu binden, wird von einer detoxifizierenden Wirkung ausgegangen. Ob allerdings das Abfangen tatsächlich mit einer Aufhebung des toxischen Potenzials einhergeht, ist wenig untersucht. Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass Methallothionein, das 3,23 Mol Cd(II), 1,41 Mol Cu(II) und 0,77 Mol Zn(II) enthält, sowohl eine konzentrationsabhängige Zunahme von Einzelstrangbrüchen in PM2-DNA verursacht, als auch die Aktivität des Fpg-Proteins im PM2-Assay hemmen kann (Hoffmann, 2000). Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass trotz der Bindung an Methallothioneine, Metall-Ionen ihre toxische Eigenschaft ausüben können. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass sowohl lösliches CdCl 2 als auch partikuläres CdO in der Lage sind, die Struktur des Tumorsuppressorproteins p53 zu beeinflussen. Beide Verbindungen führen zu einer Induktion der mutanten Konformation. Als mögliche Folge könnten Signaltransduktionswege gestört werden, die zu einem veränderten Expressionsmuster von z.b. für die Reparatur und die Zellzykluskontrolle entscheidenden Proteine p21, p48 und XPC führen (Abbildung 44). Vor dem Hintergrund, dass frühere Studien eine Hemmung der Schadenserkennung UV-induzierter DNA-Addukte in Folge eine 77

84 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick Cadmiumbehandlung zeigen (Hartmann und Hartwig, 1998), scheint dieses Resultat eine mögliche Erklärung für die Cadmium-vermittelte Kanzerogenese zu liefern. Abbildung 45: Schematische Darstellung des möglichen Mechanismus der durch Cadmium-vermittelten Kanzerogenese. 78

85 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick Da auch Studien zur Reparatur von BPDE eine Beteiligung von p53 zeigen konnten und vor allem Arbeiter der metallverarbeitenden Industrie aber auch die Allgemeinbevölkerung u.a. durch Zigaretten oder Flugasche einer Mischexposition von oftmals partikulären Metallverbindungen und zahlreichen mutagenen Agenzien wie UV-Strahlung, PAKs oder Aflatoxinen ausgesetzt sind, kann diesem Protein eine entscheidende Funktion in der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität zugeschrieben werden (Lloyd und Hanawalt, 2000; Wani et al., 2002; Lloyd und Hanawalt, 2002). 79

86 Literatur 7 Literatur Abraham, R. T. (2001). Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases. Genes Dev 15(17): Adimoolam, S. and Ford, J. M. (2002). p53 and DNA damage-inducible expression of the xeroderma pigmentosum group C gene. Proc Natl Acad Sci U S A 99(20): Adimoolam, S. and Ford, J. M. (2003). p53 and regulation of DNA damage recognition during nucleotide excision repair. DNA Repair (Amst) 2(9): Adimoolam, S., Lin, C. X. and Ford, J. M. (2001). The p53-regulated cyclin-dependent kinase inhibitor, p21 (cip1, waf1, sdi1), is not required for global genomic and transcription-coupled nucleotide excision repair of UV-induced DNA photoproducts. J Biol Chem 276(28): Alarcon-Vargas, D. and Ronai, Z. (2002). p53-mdm2-the affair that never ends. Carcinogenesis 23(4): Allison, S. J. and Milner, J. (2004). Remodelling chromatin on a global scale: a novel protective function of p53. Carcinogenesis 25(9): Asmuss, M., Mullenders, L. H., Eker, A. and Hartwig, A. (2000). Differential effects of toxic metal compounds on the activities of Fpg and XPA, two zinc finger proteins involved in DNA repair. Carcinogenesis 21(11): Bartek, J. and Lukas, J. (2001). Pathways governing G1/S transition and their response to DNA damage. FEBS Lett 490(3): Bi, X., Slater, D. M., Ohmori, H. and Vaziri, C. (2005). DNA polymerase kappa is specifically required for recovery from the benzo[a]pyrene-dihydrodiol epoxide (BPDE)-induced S-phase checkpoint. J Biol Chem 280(23): Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: Bustin, S. A. (2000). Absolute quantification of mrna using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol 25(2): Cadwell, C. and Zambetti, G. P. (2001). The effects of wild-type p53 tumor suppressor activity and mutant p53 gain-of-function on cell growth. Gene 277(1-2): Calmels, S., Hainaut, P. and Ohshima, H. (1997). Nitric oxide induces conformational and functional modifications of wild-type p53 tumor suppressor protein. Cancer Res 57(16): Caspari, T. (2000). How to activate p53. Curr Biol 10(8): R Chan, W. M., Siu, W. Y., Lau, A. and Poon, R. Y. (2004). How many mutant p53 molecules are needed to inactivate a tetramer? Mol Cell Biol 24(8): Chen, X., Zhang, Y., Douglas, L. and Zhou, P. (2001). UV-damaged DNA-binding proteins are targets of CUL-4A-mediated ubiquitination and degradation. J Biol Chem 276(51):

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95 Anhang A Anhang A.1 Abkürzungsverzeichnis A549 - Menschliche Lungenadenokarzinomzelllinie B[a]P - Benzo[a]pyren BER - Basenexzisionsreparatur Bp - Basenpaare BSA - Rinderserumalbumin BSO - Buthionin Sulfoximin CAK - CDK activating kinase CdCl 2 - Cadmiumchorid CDK - Cyclin dependent kinase cdna - komplementäre DNA CdO - Cadmiumoxid cm - Zentimeter CPD - Cyclopyrimidindimere Ct - Thresholdycle Cys - Cystein DDB - damage DNA binding Protein DMEM - Dulbecos Modified Eagle Medium DMSO - Dimethylsulfoxid DNA - Desoxyribonukleinsäure E - Effizienz EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure FDP - Formamid-Denaturieungspuffer Fpg - Formamidopyrimidin-DNA Glycosylase FKS - Fötales Kälberserum GAPDH - Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase GGR - Globale Genomische Reparatur GSH - Glutathion GSSG - Glutathiondisulfid 89

96 Anhang h - Stunde HeLa S3 - menschliche Cervixkarzinomzelllinie His - Histidin IARC - International Agency for Research on Cancer Ig - Immunglobulin J - Joule kd - Kilodalton mdm2 - murine double minute 2 MMR - Mismatchreparatur MOPS - Morpholinopropansulfonsäure mrna - messenger Ribonukleinsäure NER - Nukleotidexisionsreparatur OGG - 8-Oxoguanin-DNA-Glycosylase Oligo(dT) - Oligodesoxythymidin PAK - Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe PCR - Polymerase Chain Reaction PBS - Phosphat-gepufferte Salzlösung PCNA - proliferating cell nuclear antigen PMSF - Phenylmethansulfonylfluorid PVDF - Polyvinylidenfluorid Ref1 - Redoxfaktor 1 RFU - relative Fluoreszenzunit RPA - Replikationsprotein A ROS - reaktive Sauerstoffspezies rrna - ribosomale RNA RT-PCR - reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion SD - Standardabweichung SDS - Natriumdodecylsulfat Taq-Polymerase - Thermus aquaticus Polymerase Tris - Tris-(hydroxylmethyl)-aminomethan UV - Ultraviolettes Licht V79 - Lungenfibroblasten des chinesischen Hamsters XP - Xeroderma Pigmentosum 90

97 Anhang A.2 Liste der verwendeten Chemikalien Bezeichnung: Hersteller: Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung 37,5:1 (40 %) Agarose Ammoniumperoxodisulfat Anti-Kaninchen-Antikörper-HRP Anti-Maus-Antikörper-HRP Anti-p53-Antikörper (Maus) Anti-p53-Antikörper (Kaninchen) Anti-p53-Antikörper (PAb 1620) Anti-p53-Antikörper (PAb 421) Aprotinin β-mercaptoethanol Bradford-Lsg Bromphenolblau BSA ( 96 %) CdCl 2 (99,99 + %) CdO (99,99 + %) DAPI/SR-Lösung DMEM DMSO p.a. EDTA p.a. ECL-Detektionslösung Ethanol p.a. Ethidiumbromid p.a. First Strand cdna Synthesis Kit Formaldehyd Formamid FKS Glycerol Merck, Darmstadt Sigma, Deisenhofen Merck, Darmstadt Santa Cruz, Santa Cruz (USA) Santa Cruz, Santa Cruz (USA) Dako, Glostrup (Dänemark) Novocastra, Newcastle (UK) Oncogene, San Diego (USA) Oncogene, San Diego (USA) Sigma, Deisenhofen Merck, Darmstadt Bio-Rad, München Merck, Darmstadt Sigma, Deisenhofen Aldrich, Steinsheim Aldrich, Steinsheim Partec, Münster Sigma, Deisenhofen Sigma, Deisenhofen Merck, Darmstadt Amersham, Freiburg Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Bio-Rad, München Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Sigma, Deisenhofen Merck, Darmstadt 91

98 Anhang Guanidin-Isothiocyanat Isopropanol iq SYBR Green Supermix (2x) KCl Leupeptin Magermilchpulver Methanol Molekulargewichtsmarker RPN 800 MOPS NaCl p.a. Na 2 HPO 4 p.a. NaH 2 PO 4 p.a. NaOH p.a. PCR-Primer Penicillin/Streptomycin 5000IU/ml Pepstatin A Protein G PLUS/Protein A Agarose Lösung SDS (10 % in Wasser) TEMED Tris Triton X-100 Trypsin (10x) Merck, Darmstadt Sigma, Deisenhofen Bio-Rad, München Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Riedel-de Haen, Seelze Amersham, Freiburg Sigma, Deisenhofen Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt MwG Biotech, Ebersberg Sigma, Deisenhofen Sigma, Deisenhofen Oncogene, San Diego (USA) Merck, Darmstadt Serva, Heidelberg Sigma, Deisenhofen Pierce, Rockford (USA) Sigma, Deisenhofen 92

99 Anhang A.3 Liste der verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialen Bezeichnung: Hersteller: Auflichtmikroskop Axiovert 25 Bildauswerteprogramm (Aida Image Analyzer) Biophotometer Bottle Top Filter (0,2 µm) Brutschrank Hera cell Digitalwaage Durchflusszytometer PAS Elektrophoresekammer Geldokumentationssystem Fuji LAS 3000 H 2 O Aufbereitungsanlage Ultra Clear icycler (96 x 0,2 ml Modul) icycler iq Optical System Software (3.1) Kolbenhubpipetten Kryoröhrchen Kühlschrank Kulturschalen Küvetten (UVetten) Magnetrührer 24-Mikrotiterlochplatten Mikrotiterplattenlesegerät Mykoplasmendetektionskit Netzgerät Neubauer-Zählkammer PCR-Reaktionsgefäße PCR-Reaktionsgefäße (8er Streifen) PCR-Reaktionsgefäße (96 Lochplatte) ph-meter ph 320 Zeiss, Oberkochen Raytest, Straubenhardt Eppendorf, Köln Nalgene, Hamburg Heraeus, Hanau Sartorius, Göttingen Partec, Münster Hoefer, Wiesloch Raytest, Straubenhardt SG, Barsbüttel Bio-Rad, München Bio-Rad, München Eppendorf, Hamburg Greiner, Frickenhausen Liebherr, Ochsenhausen Biochrom, Trasadingen (Schweiz) Eppendorf, Köln Heidolph, Schwabach Sarstedt, Nümbrecht Tecan, Crailsheim Minerva Biolabs, Berlin Bio-Rad, München Marienfeld, Lauda-Königshofen Bio-Rad, München Sarstedt, Nümbrecht Sarstedt, Nümbrecht WTW, Weilheim 93

100 Anhang Pipettenspitzen Pipettierhilfe Pipetus Ready-To-Go-PCR-Kit Reaktionsgefäße, 1,5/2 ml Rotator Spritzen Sterilbank Hera safe Stickstoffbehälter Thermocycler Tiefkühlschrank Ultraschall-Sonifier 250 UV-Lampe UV-Radiometer Vakuum-Zentrifuge Vortex Genie 2 Wasserbad Zellzähler Casy-1 Zellzyklusanalysensoftware FloMax Zentrifuge Biofuge pico Zentrifuge Zentrifugenröhrchen (15, 50 ml) Eppendorf, Köln Hirschmann, Eberstadt Amersham, Freiburg Eppendorf, Köln Neolab, Heidelberg Braun, Melsungen Heraeus, Hanau MVE, Burnsville (USA) MJ Research, USA GFL, Burgwedel Branson, Hannover Bioblock Scientific, Illkirch Cedex (F) PRC Krochmann, Berlin Heto, DK Scientific Industries, USA Julabo, Seelbach Schärfe System, Reutlingen Partec, Münster Heraeus, Hanau Eppendorf, Köln Sarstedt, Nümbrecht 94

101 Anhang A.4 Verwendete Lösungen und Puffer Alle Lösungen werden mit über Austascherkanülen aufgereinigtem destilliertem Wasser angesetzt. Die Medien und Lösungen für die Zellkultur werden sterilfilriert. A.4.1 Zellkultur A549 Kulturmedium DMEM 10 % FKS 100 U/ml Penicillin 100 µg/ml Streptomycin PBS, ph 7,4 100 mm NaCl 7 mm Na 2 HPO 4 4,5 mm KCl 3 mm KH 2 PO 4 PBS-EDTA, ph 7,4 100 mm NaCl 7 mm Na 2 HPO 4 4,5 mm KCl 3 mm KH 2 PO 4 3 mm EDTA Trypsin-Lösung 0,25 % Trypsin in PBS-EDTA 95

102 Anhang A.4.2 Präparation der Proteinextrakte, Proteinbestimmung, Elektrophorese und Westernblot RIPA-Zelllysepuffer 10 mm Tris, ph 7,6 150 mm NaCl 1mM EDTA 1 % Triton X % Na-Desoxycholat 0,1 % SDS 1 mm PMSF Blockierlösung 5 % Magermilchpulver in PBS Bradfordlösung 1:5 - Verdünnung Bio-Rad-Protein-Assay-Reagenz mit H 2 O bidest BSA-Stammlösung 100 µg/ml in H 2 O Lämmli-Laufpuffer (1x) 192 mm Glycin 25 mm Tris 0,1 % SDS Lämmli-Ladepuffer (4x) 320 mm Tris 8 % SDS 32 % Glycerin 8 % Mercaptolethanol 0,04 % Bromphenolblau 96

103 Anhang Trenngelpuffer 1,5 M Tris ph 8,8 Sammelgelpuffer 1 M Tris ph 6,8 Transferpuffer 192 mm Glycin 20 mm Tris 0,01 % SDS 10 % Methanol Trenngel 12 % Acrylamid 375 µm Tris 0,1 % SDS ca. 0,1 % APS ca. 1:1000 TEMED Sammelgel 5 % Acrylamid 125 µm Tris 0,1 % SDS ca. 0,1 % APS ca. 1:1000 TEMED Immunpräzipitationspuffer 10 mm Tris ph 7,6 140 mm NaCl 0,5 % NP40 0,5 mm PMSF (Stammlösung: 18 mg/ml in Isopropanol) 0,5 µg/ml Leupeptin (Stammlösung: 0,2 mg/ml in H 2 O) 2 µg/ml Aprotinin (Stammlösung: 0,3 mg/ml in 50 mm Tris ph 7) 0,7 µg/ml Pepstatin A (Stammlösung: 1,05 mg/ml in DMSO) 97

104 Anhang Waschpuffer PBS mit 0,3 % Tween 20 A.4.3 RNA-Isolierung und Elektrophorese MOPS ph 7,0 (20x) 400 mm MOPS 100 mm Na-Acetat 10 mm EDTA Ethidiumbromid-Lösung 10 mg/ml in H 2 O FDP (Formamid-Denaturierungspuffer) 54 µl H 2 O 35 µl Formalin (37 %) 10 µl MOPS (20x) 100 µl Formamid (rekristallisiert) 1 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml) Agarosegel 1,2 g Agarose 83 ml H 2 O 5 ml MOPS (20x) 12 ml Formaldehyd (37 %) RNA-Laufpuffer 1x MOPS 98

105 Anhang A.5 Primersequenzen GAPDH reverse: 5 - GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG -3 GAPDH forward: 5 - CTG CAC CAC CAA CTG CTT AG -3 p48 reverse: 5 - GCT GGC TTT CCC TCT AAC CTG -3 p48 forward: 5 - CCT GAA CCC ATG CTG TGA TTG -3 XPC reverse: 5 - GGC CAC GCG GTG TAG AT -3 XPC forward: 5 - CGT GGA CGG GAA GGT GC -3 p21 reverse: 5 - GTA CCA CCC AGC GGA CAA GT -3 p21 forward: 5 - CCT CAT CCC GTG TTC TCC TTT -3 A.6 Darstellung eines RNA-Gels nach der RNA-Isolation Die qualitative Kontrolle der RNA-Isolation erfolge über eine denaturierende RNA- Gelelektrophorese. Da die ribosomale RNA (rrna) den größten Anteil an der Gesamt-RNA einnimmt und eine definierte Größe besitzt, weisen die zwei scharfe Banden der 28 S rrna und der 18 S rrna auf eine gute Integrität und geringe Denaturierung hin. 28 S rrna 18 S rrna Abbildung 46: RNA-Gel zur Kontrolle der Integrität der isolierten RNA. 1 µl des RNA-Isolates wird pro Tasche aufgetragen und das Gel zwei Stunden bei 60 V und maximaler Amperezahl laufen gelassen. Zur Dokumentation wird das Gel bei 520 nm abfotografiert. 99

106 Anhang A.7 Histogramme der Zellzyklusanalyse Beispielhaft sind im Folgenden zwei Histogramme dargestellt, die die Zellzyklusphasenverteilung 10 Stunden nach einer UVC-Bestrahlung mit 5 J/m 2 (Abbildung 47 B) im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen (Abbildung 47 A) zeigen. A B Abbildung 47: Histogramme der Zellzyklusanalyse von Ko (A) und UVC (10 h, 5 J/m 2 ) (B). A.8 Dosis-Abstands-Kurve Um bei den Versuchen mit dem DNA-schädigenden Agens UVC-Strahlung eine konstante Dosis von 5 J/m 2 einsetzen zu können, wurden im Vorfeld die geeigneten Parameter wie Bestrahlungsabstand und Bestrahlungszeit festgelegt. Mit der in Abbildung 48 angegebenen Leistung der Strahlungsquelle bei definiertem Abstand wird mit folgender Gleichung die Bestrahlungszeit bei einem Abstand von 30 cm auf 5 sec bei festgelegt. Watt = Joule/Sekunde 100

107 Anhang Abbildung 48: Aufnahme der Strahlungsintensität in Abhängigkeit von dem Abstand zur Strahlenquelle mittels UV-Radiometer. A.9 cdna-verdünnungreihen Die Verdünnungreihen wurde aus den entsprechenden cdna-proben hergestellt und dann jeweils 1 µl der jeweiligen cdna-verdünnung in die PCR eingesetzt. A B C D Abbildung 49: cdna-verdünnungsreihen mit den verwendeten Primern für GAPDH (A), p48 (B), XPC (C) und p21 (D). 101