3. Flüssigchromatographie. 3.1 Einleitung/Messprinzip

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1 41 3. Flüssigchromatographie 3.1 Einleitung/Messprinzip Als Flüssigchromatographie werden jene chromatographischen Verfahren bezeichnet, bei denen als mobile Phase eine Flüssigkeit verwendet wird. Die stationäre Phase wird entweder in Säulen eingefüllt (Säulenchromatographie) oder auf Platten aufgebracht (Flachbettverfahren: Dünnschichtchromatographie, Papierchromatographie). Für die Bezeichnung der heute üblichen Flüssigkeits-Chromatographie hoher Trennleistung werden die folgenden Ausdrücke verwendet: Hochleistungs-Flüssigchromatographie Hochdruck- Flüssigchromatographie High Performance Liquid Chromatography (HPLC) High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) Ein wesentlicher Unterschied der Flüssigchromatographie gegenüber der Gaschromatographie besteht darin, dass auch sehr polare und thermisch labile Substanzen gemessen werden können. Der grosse praktische Durchbruch der Flüssigchromatographie kam mit dem Gebrauch von Hochdruckpumpen, die einen Druck von bar aufrechterhalten können. Dies erlaubt den Einsatz von sehr dicht gepackten Säulen, was wesentlich die Trenneffizienz der Methode beeinflusst.

2 Apparatur a) b) c) d) e) Vorrat Pumpe Injektor Filter Säule Detektor a) Eluentvorrat/Pumpe: Der Eluent wird aus einem Vorratsgefäss mit einer Hochdruckpumpe auf die Säule geleitet. Bevor der Eluent die Pumpe erreicht, werden in einem Entgaser (degasser) gelöste Gase (Stickstoff, Sauerstoff) entfernt um Blasenbildung in der Pumpe oder der Säule zu verhindern. Hierzu wird der Eluent z.b. in einem Teflonschlauch durch eine Vakuumkammer geführt, wo die gelösten Gase von der Flüssigkeit durch die poröse Schlauchwand in die Vakuumkammer diffundieren. An HPLC-Pumpen werden sehr hohe Ansprüche gestellt, da sie reproduzierbar und pulsationsfrei Drücke von bis zu 400 bar aufrechterhalten müssen. b) Injektor Die Probe wird meist mit einer Spritze durch eine spezielle Injektionsschleife in den Eluentenstrom eingebracht. Typische Injektionsvolumina betragen 10-50µl. Injektion der Probe: Probe Pumpe Säule Abfall

3 43 Ausspülen der Probe in die Säule: Pumpe Säule Abfall c) Filter Da Partikel im Eluent oder aus der Probe die sehr dicht gepackten HPLC-Säulen verstopfen können, wird die Probe entweder vor der Injektion oder direkt vor der Säule gefiltert. d) Säule HPLC-Säulen sind meist Stahlrohre (seltener Glas, wegen des hohen Drucks) mit typischen Längen von 10-50cm und Innendruchmessern von 1-10mm. HPLC-Säulen sind in den meisten Fällen mit porösen Partikeln von 3-10µm Durchmesser gepackt, wobei eine dichte und einheitliche Packung wichtig ist. Die Partikel bestehen meist aus Kieselgel, Aluminiumoxid, Zirkonoxid oder Polymeren und weisen eine enge Grössenverteilung auf. Je nach Verwendungszweck kommen poröse oder nicht poröse Partikel zum Einsatz, die häufig mit einer organischen Phase beschichtet werden. Kieselgel ist die am häufigsten eingesetzte stationäre Phase. e) Detektoren Es muss darauf geachtet werden, dass die Totvolumina zwischen Säulenende und Detektor möglichst klein sind, damit keine unnötige Bandenverbreiterung auftritt.

4 44 Gradientenelution Wenn ein Substanzgemisch sehr unterschiedliche Polaritäten aufweist, kann es hilfreich sein, die Zusammensetzung des Eluenten während eines Chromatograms zu ändern. Dies nennt man Gradientenelution - im Gegensatz zur isokratischen Elution, bei der die Eluentzusammensetzung über das ganze Experiment konstant bleibt. Gradientenelution führt häufig zu schärferen Peaks und kürzeren Retentionszeiten. Vergleich einer a) isokratischen Elution und b) einer Gradientenelution

5 Flüssigkeitschromatographische Trennmethoden Aufgrund der vielfältigen stationären Phasen unterscheidet man in der Flüssigkeitschromatographie verschiedene Unterarten. Folgende Verteilungsprinzipien kommen zur Anwendung: Adsorption: die Analyten werden an der Oberfläche physikalisch adsorbiert (Adsorptionschromatographie). Verteilung: Absorption in die (organische) stationäre Phase (Verteilungschromatographie) Ionische Wechselwirkung (Ionenaustauschchromatographie) Grössenabhängige Diffusion in enge Poren der stationären Phase (Gelpermeationschromatographie) Stationäre Phasen, die nach dem Prinzip der Adsorption oder Absorption eine Trennung von Analyten bewirken, werden weiter unterteilt in Normalphasen (polare Eigenschaften) und Umkehrphasen (Reversed Phase, aploare Eigenschften). Die Benennung in Normalphase und Umkehrphase hat historische Gründe, da zuerst polare Phasen (Normalphasen) eingesetzt wurden, bevor man die heute häufiger verwendeten Umkehrphasen entwickelte. Die Trennung der meisten Normalphasen beruht auf der Stärke der Wechselwirkung von den Analyten mit den aktiven Stellen der stationären Phase. (z.b. Silanolgruppen bei Kieselgel). Dabei tritt der Analyt in Konkurrenz mit den Eluentmolekülen, die ebenfalls an der Oberfläche der stationären Phase adsorbieren können. Man kann sich vorstellen, dass die Analytmoleküle die Eluentmoleküle (die immer in grosser Überzahl vorhanden sind) von der Oberfläche der stationären Phase verdrängen müssen um retardiert zu werden. Sehr polare Eluenten können also nur geringfügig von der stationären Phase verdrängt werden, wodurch die Analyten schneller in der mobilen Phase ausgeschwemmt werden, d.h. es sind kleine Retentionszeiten zu beobachten. Man spricht von einer elutropen Reihe von Lösungsmitteln für Normalphasen-Säulen, wobei polare Eluenten eine grosse Elutionskraft besitzen und kurze Retentionszeiten zur Folge haben. Elutrope Reihe: Hexan < Cyclohexan < Toluol <Dichlormethan < Trtrahydrofuran < Acetonitril < Ethanol < Methanol < Wasser Je nach Polarität der stationären Phase kann diese Reihenfolge auch leicht ändern.

6 Adsorptionschromatographie Die Adsorptionschromatographie (Flüssigkeits-Festkörper-Chromatographie) gehört zu den ältesten chromatographischen Methoden (Tswett, 1906). Die Retention wird bei der Adsorptions-chromatographie durch die Wechselwirkung zwischen den Probenmolekülen und den aktiven Stellen einer festen stationären Phase (Adsorbens) verursacht. Das Adsorbens ist ein poröser Festkörper mit grosser Oberfläche ( m 2 /g) wie z. B. Silicagel und Aluminiumoxid. Die Trennung der Probenmoleküle an polaren Adsorbentien wie Silicagel oder Aluminiumoxid (Normalphasen) erfolgt durch Polaritätsunterschiede, wobei polare Probenmoleküle stärker adsorbiert werden als apolare. Für die Abhängigkeit der Elution von der Art der funktionellen Gruppen der Probenmoleküle lässt sich deshalb eine empirische Reihenfolge aufstellen: Fluorierte, gesättigte Kohlenwasserstoffe < gesättigte Kohlenwasserstoffe < Aromaten < halogenierte Verbindungen < Aether < Nitrile < Nitroverbindungen < Ester < Ketone < Aldehyde < primäre Amine < Amide < Phenole < Carbonsäuren. Die Adsorptionschromatographie erzielt oft gute Trennungen von Isomerengemischen, wird aber im Allgemeinen nicht sehr häufig angewandt.

7 Verteilungschromatographie Man unterscheidet zwei Formen der Verteilungschromatographie: Die Flüssigkeits- Flüssigkeits-Chromatographie bei der flüssige stationäre Phasen verwendet werden und Chromatographie an gebundenen Phasen, bei der die organische stationäre Phase an einer Oberfläche immobilisiert wird Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie Die Trennung in der Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie beruht auf der unterschiedlichen Verteilung der Analyten zwischen der stationären Phase (aufgesogen von einem porösen, inerten Festkörper (Träger)) und der mobilen Phase. Die mobile und die stationäre Phase sollten dabei nicht miteinander mischbar sein. stationäre Phase: ein dünner in Film den in Poren den Poren mobile Phase Verteilungsgleichgewicht Die für die Chromatographie generell geforderte Nichtmischbarkeit von mobiler und stationärer Phase führt oft zu praktischen Schwierigkeiten (Sättigungsprobleme, mangelnde Stabilität, etc.), so ist z.b. keine Gradienten-Elution möglich. Zudem bedingt der ständige Verlust der stationären Phase (die nur durch physikalische Adsorption an den Teilchen des Packungsmaterials zurückgehalten wird) eine periodische Erneuerung/Wiederauftragen der stationären Phase. Aus diesen Gründen ist die Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie für Routineanalysen weniger gut geeignet.

8 48 Entsprechend der Polarität der stationären Phase unterscheidet man grundsätzlich zwischen zwei Arten: Stationäre Phase Mobile Phase Elutionsreihenfolge Bezeichnung der Analyten polar apolar (z.b. Hexan) apolar vor polar Normalphasen apolar polar (z.b. Wasser) polar vor apolar Umkehrphasen (reversed-phase) Chromatographie an chemisch gebundenen Phasen Wird die stationäre Phase chemisch kovalent an die Partikel der Packung gebunden, spricht man von Chromatographie an chemisch gebundenen Phasen. Dies erhöht die Stabilität gegenüber auswaschen durch die mobile Phase. Chromatographie an gebundenen Phasen ist deshalb heute eine der am häufigsten verwendeten Verfahren. Säulenmaterial für chemisch gebundenen Phasen Die organische stationäre Phase wird meist an Kieselgel-Partikel gebunden, die Durchmesser von 3-10µm haben. Kieselgel hat den Vorteil, dass es mechanisch stabil ist (was bei den hohen Drücken der HPLC nötig ist) und dass organische Verbindungen relativ einfach und vor allem in dichter Packung daran gebunden werden können. Es werden z.t: poröse Teilchen verwendet wobei auf eine enge Verteilung der Porengrösse geachtet werden muss. Meist werden apolare Beschichtungen verwendet, also Umkehrphasen; es gibt aber auch chemisch gebundene Normalphasen.

9 49 Für eine unpolare stationäre Phase werden meist Alkysilyl-Verbindungen an die Oberfläche der Kieselgelpartikel gebunden. R H 3 C Si CH 3 R H 3 C Si CH 3 Oberflaeche des Partikels OH OH Si O Si O OH Si O OH Si + ClSi(CH 3 ) 2 R - HCl OH O Si O Si O OH Si O O Si R sind oft C 2 -C 18 -Alyklketten. Mit diesen Substitutionsreaktionen können aufgrund sterischer Limitierungen oft nur die Hälfte oder weniger der Silanolgruppen derivatisiert werden. Somit ist die stationäre Phase immer noch relativ polar. Um einen Teil der restlichen OH-Gruppen auch noch umzusetzen kann ein end-capping durchgeführt werden, indem man Si(CH 3 ) 3 -Gruppen mit der Oberfläche reagieren lässt. Durch die Länge des Alkylrestes kann die Trenneigenschaft der Säule wesentlich beeinflusst werden. Eine lange C 18 -Kette weist eine deutlich höhere Trennleistung auf als eine C 1 -Phase. Zusammen mit der Länge der Alkylkette beeinflussen auch die Packungsdichte, und der Grad des end-cappings die Retentionseigenschaften einer Phase. Alle diese Parameter werden zusammenfassend als Kohlenstoff-Gehalt einer Säule bezeichnet, um verschiedene Säulen miteinander vergleichen zu können. Diese sehr aploaren Phasen bedingen den Einsatz von polaren mobilen Phasen wie Wasser oder Methanol. An die organischen Alkylreste der stationären Phasen können polare Substituenten gebunden werden, um die Polarität der gebundenen Phase zu erhöhen. Solche Säulen sind also Normalphasen. Übliche Alklyderivate sind Cyano-, Alkohol- oder Amino- Gruppen. Bei diesen polareren Phasen können auch apolare Eluenten wie Hexan oder Chloroform eingesetzt werden.

10 50 Einer der wesentlichen Unterschiede zwischen Flüssigchromatographie und Gaschromatographie besteht darin, dass die mobile Phase in der Flüssigchromatographie wesentlich zur Trennung der Analyten beiträgt. Eine wichtige Eigenschaft ist dabei die Polarität der mobilen Phase. Meist wird ein Eluent gewählt, der eine möglichst unterschiedliche Polarität hat wie die Analyten und eine stationäre Phase mit ähnlicher Polarität wie die Analyten. Häufig werden sogenannte Gradientenelutionen durchgeführt, d.h., die Polarität des Eluenten wird während des Experiments kontinuierlich verändert, meistens wird dabei die Elutionskraft des Eluentgemisches gegen Ende des Chromatogramms erhöht. In einer Umkehrphasen-Chromatographie kann man z.b. mit einem rein polaren Eluenten das Chromatogramm beginnen (z.b. 100% Wasser) und dann kontinuierlich immer mehr von einem apolareren Lösungsmittel dazumischen (z.b. Acetonitril), sodass der Eluent am Ende des Experiments z.b. zu 10% Wasser und 90% aus Acetonitril besteht. Bei HPLC-Säulen muss häufig auf den eingeschränkten ph-bereich geachtet werden, bei denen sie eingesetzt werden können. Polymer-Partikel als stationäre Phase sind zudem relativ druckempfindlich, sie sind aber in extremen ph-bereichen stabiler als Kieselgel-Partikel.

11 Ionen(austausch)chromatographie (IC) Ionische Analyten können mit konventionellen Säulen kaum getrennt werden. Beschichtet man jedoch Kieselgel- oder Polymer-Partikel mit Alkylketten an deren Enden sich ionisierbare funktionelle Gruppen befinden, können ionische Wechselwirkungen ausgenutzt werden um eine Trennung zu erreichen. Man nennt diese stationären Phasen Austauscherharze. Substituenten zur Trennung von Kationen und Anionen Kationentrennung Anionentrennung Sulfonsäuren: -SO - 3 H + Quartäre Amine: N(CH 3 ) + 3 HO - Carbonsäuren: -CO 2- H + Primäre Amine: NH 3+ OH - Als mobile Phase wird oft Wasser eingesetzt, dem ein Puffer beigegeben wird, wobei die Pufferionen mit den Analyten um die Austausch-Plätze an der stationären Phase konkurrieren. Mit der mobilen Phase wird auch ein gewisser ph-wert eingestellt, bei dem die stationäre Phase ionisiert wird. Elutionsreihenfolge für Kationen: Ba 2+ < Ca 2+ < Zn 2+ < Mg 2+ < Cs + < Rb + < K + < NH 4 + < Na + < H + < Li + Elutionsreihenfolge für Anionen: Citrat < Sulfat < Oxalat < Iodid < Nitrat < Phosphat < Bromid < Nitrit < Chlorid < Acetat < Hydroxid Mit IC werden hauptsächlich kleinere anorganische und organische Ionen getrennt. Als Detektoren werden fast ausschliesslich Leitfähigkeitsdetektoren eingesetzt. Die hohe Empfindlichkeit dieser Detektoren wird jedoch stark von den Pufferionen beeinträchtigt, sodass das Signal der Analytionen oft nicht mehr sichtbar ist. Es werden deshalb Supressorsäulen zwischen die eigentliche Trennsäule und den Detektor geschaltet, in der selektiv die Pufferionen neutralisiert werden. Für Kationentrennungen wird oft HCl (H + Cl - ) als Puffer eingesetzt. In der Supressorsäule findet folgende Reaktion statt: Harz-OH - + H + + Cl - Harz-Cl + H 2 O Die zu trennenden Kationen hingegen zeigen keine Wechselwirkung mit dem anionischen Harz. Für Anionentrennung (Puffer: Na + HCO 3 - ): Harz-H + + Na + + HCO 3- Harz-Na + H 2 CO 3

12 Ionenpaarchromatographie (Ion-pair chromatography, IPC) Mit Hilfe der Ionenpaar-Chromatographie lassen sich ebenfalls Proben analysieren, die ionische Komponenten enthalten. Man unterscheidet folgende Arten von Ionenpaar-Chromatographie: Normalphasen- Ionenpaar-Chromatographie Umkehrphasen Ionenpaar-Chromatographie Ionenpaar-Adsorptionschromatographie Im Falle der Ionenpaar-Chromatographie an einer Umkehrphasen-Säule wird der mobilen Phase ein Ionenpaarbildner (sogenanntes Gegenion) als Hilfskomponente zugesetzt. Als Gegenion wird z. B. das Anion der Heptansulfonsäure für kationische Proben und das Tetrabutylammoniumion (Phosphat) für anionische Proben verwendet. Zur Erklärung des Trennmechanismus werden zwei Modelle vorgeschlagen: 1) Paarbildung in der mobilen Phase. Das der mobilen Phase zugesetzte grosse Gegenion bildet mit dem ionischen Probenmolekül ein Ionenpaar. Dieses Ionenpaar verhält sich wie eine neutrale, nicht polare Verbindung, die von der Umkehrphasen- Säule zurückgehalten wird. 2) Ionenaustausch an der stationären Phase. Das Gegenion wird mit seinem organischen Teil an den Umkehrphasen-Teilchen adsorbiert. Seine ionische Funktionalität bewirkt eine Trennung nach einem Ionenaustausch-Mechanismus. Paarbildung Ionentausch

13 Gelpermeationschromatographie (Gel-Filtration, Ausschluss-Chromatographie, Size-exclusion chromatography, SEC) In der Gelpermeations-Chromatographie beruht die Trennung auf der unterschiedlichen Grösse der Analytmoleküle, wobei das Porenvolumen des Packungsmaterials ausgenützt wird. Die kleinen Moleküle haben die Möglichkeit, in die Poren des Packungsmaterials (poröse Kieselgele oder Polymere, Porengrösse Å) vorzudringen und verweilen daher länger in der Trennsäule als grosse Moleküle, welche nicht in die Poren diffundieren können und schnell durch die Zwischenräume zwischen den Packungskörnern hindurchgespült werden. Moleküle bis zu einer Masse von ca Dalton können getrennt werden, wobei ein Masseunterschied von ca. 10% für eine Trennung nötig ist. Die mobile Phase bei der Gelpermeations-Chromatographie zeigt im Idealfall keine Wechselwirkung mit dem Packungsmaterial und soll nur als Transportmittel für die Probe dienen. Aus diesem Grunde sollte die Probe in der mobilen Phase gut löslich sein. Die Probe sollte auch mit dem Packungsmaterial keine Wechselwirkungen, wie z. B. Adsorption, aufweisen. Die Beziehung zwischen der Elutionszeit (-volumen) und der Molekülgrösse (oder relativen Molmasse) für ein bestimmtes Packungsmaterial wird mittels Eichkurven dargestellt:

14 54 Der lineare Bereich der Eichkurve wird im wesentlichen durch die Porengrösse bestimmt. Somit kann durch die Wahl eines Packungsmaterials mit einer entsprechenden Porengrösse der jeweils gewünschte Molmassenbereich abgedeckt werden. Durch Verwendung von langen Trennsäulen erhält man genügend Porenvolumen und Trennleistung. Zur Steigerung der Trennleistung wird oft bei erhöhter Temperatur gearbeitet Affinitäts-Chromatographie Die Affinitäts-Chromatographie nutzt spezifischen Wechselwirkungen aus, die bei vielen biochemischen Systemen zu beobachten sind (z. B. Antigen/Antikörper; Enzym/Substrat), um z.b. Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren und anderen Klassen von natürlich vorkommenden Verbindungen zu isolieren. Zu diesem Zweck wird ein spezifisches Protein oder ein anderes, biospezifisches Molekül (oft als Ligand bezeichnet) an einen unlöslichen Träger (z. B. Agarose-Gel, Cellulosederivate, Polyacrylamid-Gel) kovalent gebunden. Die Affinitätschromatographie unterscheidet sich im experimentellen Verlauf leicht von einem normalen chromatographischen Experiment. Es wird selektiv eine entsprechende Substanz durch Komplexbildung mit dem trägergebundenen Liganden auf der Säule festgehalten, während alle anderen Begleitsubstanzen von der Säule gespült werden. Anschliessend wird der Komplex durch Änderung der mobilen Phase (z. B. ph, Ionenstärke) zerlegt und die gewünschte Substanz in gereinigter, konzentrierter Form von der Säule eluiert.

15 Detektoren Eine Vielzahl von Detektoren wird für HPLC-Analysen eingesetzt, wobei es keine universellen Detektoren gibt, wie etwa den FID in der Gaschromatographie. HPLC- Detektoren können in zwei Gruppen eingeteilt werden: solche, die ausschliesslich auf die Analyten ansprechen, wobei darauf zu achten ist, dass der Eluent nicht zu stark auf solche Detektionsmehtoden anspricht. Andere Detektoren sprechen auf Eigenschaften der gesammten Lösung an (=Eluent + Analyt), wobei Änderungen von reinem Eluent und Eluent+Analyt gemessen werden UV/VIS-Detektor Die Ultraviolett Absorption ist eine der meist verwendete LC-Detektionsmethode aufgrund der guten Empfindlichkeit für viele Substanzklassen und der relativen Unempfindlichkeit gegenüber Lösungsmittelgradienten. Hauptnachteil: Nur empfindlich auf Substanzen mit UV Absorptionen bei grösserer Wellenlänge als diejenige vom Lösungsmittel. Typische absorbierende Gruppen: - Br, I, S - C=O - 2 oder mehr konjugierte Doppelbindungen - Aromatische Ringe Um das Signal zu maximieren muss ein möglichst langer Absorptionspfad genutzt werden, wobei zu lange Messwege die Auflösung beeinträchtigen können. Deshalb sind die Messvolumina oft auf 1-10µl beschränkt. Eluent von Säule UV-Strahl Bei einfachen Detektoren wird die Absorption bei nur einer Wellenlänge gemessen. Bessere (und teurere) Detektoren können simultan ein ganzes UV-Spektrum aufnehmen (Diodenarray-Detektoren). Somit kann ein Spektrum von ca nm für jeden Peak aufgenommen werden.

16 Brechungsindex-Detektor Der Brechungsindexdetektor ist ebenfalls weit verbreitet. Der Brechungsindex eines reinen Lösungsmittels ist nicht (oder sehr selten) gleich jenem eines Analyt- Lösungsmittelgemisches. Der Brechungsindexdetektor ist allgemeiner einsetzbar als der UV Detektor, da der Brechungsindex fast aller Substanzen unterschiedlich ist zu jenen der Lösungsmittel. Die Empfindlichkeit des Detektors ist eine Funktion des Analyt-Lösungsmittelpaars. Sie hängt somit nicht nur vom Analyt, sondern auch vom Lösungsmittel ab. Einer der grössten Nachteile ist jedoch seine geringe Empfindlichkeit. Photodioden- Detektor Photodiode Mobile Phase von der vonsäule Spiegel Lichtstrahl Optische Kuvette Die durchgezogene Linie in der Abbildung zeigt den Strahlengang, wenn reines Lösungsmittel durch die Kuvette fliesst. Der Strahl kommt auf der Photodiode an. Die gestrichelte Linie zeigt der Strahlengang wenn Analyt mit dem Lösungsmittel durch die Kuvette fliesst. Der Lichtstrahl wird seitlich versetzt, und die Photodiode sieht ihn weniger, oder nicht mehr. Falls mit Gradientenelution gearbeitet wird, muss eine Refenzzelle benutzt werden IR-Detektor Ein IR-Detektor ist im Prinzip ähnlich aufgebaut wir ein UV-Detektor, wobei ein Infrarotstahl durch eine Kuvette geschickt wird und das IR-Absorptionsspektrum des Eluenten (+Analyt) aufgenommen wird. Da das Lösungsmittel auch IR-Absorptionsbanden hat, muss es sorgfältig ausgewählt werden, um die Analytbanden nicht zu überdecken. Aufgrund dieser Limitierungen kann ein IR-Detektor oft nur begrenzt eingesetzt werden. Die Empfindlichkeit der IR-Detektoren ist nicht besonders gut, und etwa vergleichbar mit jener des Brechungsindexdetektors.

17 Fluoreszenz-Detektor Wenn die zu analysierende Substanzen fluoreszieren, ist dieser Detektor wegen seiner hohen Empfindlichkeit, die rund 1000 mal besser ist als jene eines UV Detektors, sehr vorteilhaft. Für nicht fluoreszierende Verbindungen können z.t. Derivate hergestellt werden, welche fluoreszierende Eigenschaften haben. Photodetektor Wellenlängeselektives Element Anregungslicht Kuvette Kuvette (von (von oben) oben gesehen) vom Eluat durchspült Einfache Geräte benutzen eine fixe Anregungswellenlänge, und Glasfilter um das Fluoreszenzlicht selektiv zu beobachten. Bessere Geräte benutzen Monochromatoren am Ein- und Ausgang um Empfindlichkeit und Selektivität zu optimieren Leitfähigkeits-Detektor Leitfähigkeit ist vor allem als Detektionseigenschaft für Ionen von Interesse. Die Leitfähigkeit des Lösungsmittels darf aber nicht sehr hoch sein, da dies eine sehr geringe Messempfindlichkeit zur Folge hätte. Zur Trennung von Ionen werden jedoch häufig gepufferte mobile Phasen eingesetzt. Deshalb werden die Pufferionen in kleinen Säulen vor dem Leitfähigkeitsdetektor neutralisiert (siehe Kap ) Massenspektrometrie-Detektor Das Grundproblem für die Kopplung von LC mit MS-Detektoren besteht darin, dass die Probe für eine MS-Messung immer in gasförmiger Form vorliegen muss. Wenn dies, wie bei der Flüssigchromatographie, nicht der Fall ist, muss eine geeignete Methode gefunden werden, um die Probe in die Gasphase zu bringen.

18 58 Die zwei üblichsten Arten, wie das Lösungsmittel von den Analyten getrennt wird und wie die Analyten ionisiert werden sind APCI und ESI. APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) Das Eluat wird in einer geheizten Kapillare mit einem Nebulizergas zersprüht. In der Ionisationskammer werden in einem ersten Schritt vor allem Moleküle des Lösungsmittels und des Trägergases durch eine Corona-Entladung ionisiert. Die Ionisation der Analyt-Moleküle erfolgt dann durch Reaktionen mit den Lösungsmittel-/ Trägergasionen (chemische Ionisation), was eine sehr weiche Ionisationsmethode darstellt. Weiche Ionisationsmethoden haben den Vorteil, dass die Analytmoleküle wenig fragmentieren und so häufig Identifizierungen von unbekannten Substanzen einfacher machen. Die Ionen werden daraufhin in den Vakuumteil des MS überführt, wobei meist mehrstufige Vakuumsysteme verwendet werden. Elektrode von dersäule A X X - OH - zum MS A + XA - + OH - A --> A X: Trägergas, Lösungsmittel A: Analyt Elektroprayionsation (ESI) Das Eluat wird mit einer dünnen Nadel, an der eine Hochspannung angelegt ist, versprüht. So entstehen geladene, flüssige Tröpfchen, die im Nebulizergas schnell abtrocknen. Die Ladung der Tröpfchen wird auf die Analyten übertragen. Die Einleitung ins MS kann linear oder rechtwinklig zur Einspritzrichtung sein. von der Säule 3ooo V A n+ zum MS

19 Verdampfungs-Lichtstreu-Detektor (Evaporative Light Scattering Detector, ELSD) Der ELSD ist ein relativ universeller Detektor für Verbindungen, die einen kleineren Dampfdruck als das Lösungsmittel besitzen. Der Eluent wird zersprüht und das Lösungsmittel in einer nachfolgenden Heizstrecke verdampft. Die schwererflüchtigen Analyten bleiben als kleine Partikel (mit Durchmesser im µm Bereich) im Gasstrom zurück. Mit einem Laser wird nun die Lichtstreuung der Partikel gemessen, wobei die Anzahl und Grösse der Partikel proportional zur Analytkonzentration ist. Da eventuell vorhandene Pufferionen ebenfalls ein Signal ergeben ist dieser Detektor auf Anwendungen ohne Puffer, oder nur mit flüchtigen Puffern, im Eluenten beschränkt Magnetresonanz-Spektroskopie (NMR) Wegen den hervorragenden Strukturaufklärungsmöglichkeiten ist NMR prinzipiell eine hervorragende Detektioinsmethode. NMR ist allerdings nicht sehr empfindlich, was technisch aufwendige stopped-flow Einrichtungen nötig macht, da eine NMR Messung Minuten dauern kann. Eine weitere Voraussetzung ist das Verwenden von deuterierten Lösungsmitteln. Da NMR zudem eine teure Methode ist, wird sie in der Praxis selten direkt mit LC gekoppelt. von Säule Flussschalter NMR NMR füllen normaler Fluss Elektrochemische Detektoren In diesen Detektoren wird ein Strom gemessen, der durch Analytmoleküle, die oxidiert werden, entsteht. Es gibt verschiedene Anordnungen für elektrochemische Detektoren, grundsätzlich wird aber immer ein Strom zwischen Arbeitselektrode und Gegenelektrode gemessen.

20 Derivatisierungen Generell sind zwei Typen von Derivatisierungen möglich: Vor- und Nachsäulenderivatisierungen. Die Vorsäulenderivatisierung wird meist eingesetzt, wenn Probleme bei der Trennung der Substanzen auftreten (siehe Kapital GC). Falls lediglich die Detektionseigenschaften verbessert werden sollen, kann auch eine Nachsäulen-Derivatisierung durchgeführt werden. In der HPLC werden Derivatisierungen meist in Verbindung mit UV- und Fluoreszenz-Detektoren verwendet. Häufig verwendete Derivatisierungsreagenzien in der HPLC: Funktionelle Gruppe -NH 2 (Amine, Aminosäuren) -OH (Alkohole) -CHO (Aldehyde) -CRO (Ketone) -COOH (Säuren) -SH (Thiole) Derivatisierungsreagenz 5-(N,N-Dimethylamino)- naphthalin-1- sulphonylchlorid 2,4-dinitrofluorbenzol 3,5-Dinitrobenzochlorid Silylierungsreagenzien 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) 4-Hydroazino-7- nitrobenzofurazan 4-Brommethyl-7- methoxycoumarin Dansylaziridin Beispiel: Derivatisierung von Carbonylen mit DNPH Eine Standardmethode zur Bestimmung von Aldehyden ist die Derivatisierung mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH), die nach folgendem Schema abläuft. R 1 HN NH 2 HN N R 2 O 2 N + R 1 O R 2 + Säure -H 2 O O 2 N NO 2 NO 2 Die Analyse der Reaktionsprodukte (Hydrazone) erfolgt meist mit einer RP-Säule und einer UV-Detektion.

21 Dünnschichtchromatographie (DC, Thin Layer Chromatography, TLC) Bei der DC ist die stationäre Phase nicht in einer Säule aufgebracht, sondern als dünne Schicht auf einer Glas-, Metall- oder Kunststoffträgerplatte aufgetragen. DC ist gegenüber säulenchromatographischen Methoden meist schneller und billiger, da viele Experimente gleichzeitig durchgeführt werden können. DC wird deshalb häufig zu Tests bei der Methodenentwicklung eingesetzt. Ein Nachteil der DC ist die beschränkte bzw. aufwendige Detektion DC-Platten DC-Platten haben meist Kantenlängen zwischen 5-20cm. Die Platten sind mit einer µm dicken Schicht der stationären Phase (=Partikel von 3-20µm Durchmesser) beschichtet, wobei dieselben Materialien verwendet werden wie bei der Säulenchromatographie. Es sind also Normalphasen- und Umkehrphasen DC- Experimente möglich. Die Anzahl theoretischer Böden beträgt für Hochleistungs-DC-Platten /10cm Ein DC-Experiment Die Analyten werden als Lösung an einem Ende der Platte in einem möglichst kleinen Tropfen aufgetragen, wobei viele verschiedene Proben gleichzeitig aufgetragen werden können. Nach verdampfen des Lösungsmittels wird die Platte in die Entwicklungskammer gestellt und somit in die mobile Phase getaucht. Wanderrichtung der mobilen Phase und Probe DC-Platte Probe zu Beginn des Experiments Entwicklungskammer mobile Phase

22 62 Durch Kapillarkräfte wandert die mobile Phase gleichmässig der Platte entlang hoch und trennt dabei die Substanzen im Probengemisch, die unterschiedlich schnell mit dem Lösungsmittel mitwandern. Das Experiment wird beendet, indem die Platte aus der Entwicklungskammer genommen und getrocknet wird. DC-Platte nach der Auftrennung von 2 Proben und einem Standard: aufgetrennte Substanzen Standard Probe 1 Probe 2 Startlinie Lösungsmittelfront

23 D - DC Oft wird keine gute Trennung bei einem DC mit nur einem Laufmittel erreicht. Wird nach der Entwicklung die DC-Platte getrocknet, kann man eine zweite Entwicklung mit einer mobilen Phase anderer Polarität durchführen und somit eine verbesserte Trennung erzielen. Führt man die zweite Entwicklung in 90 Grad gedrehter Laufrichtung durch spricht man von 2D-DC, die vergleichbar ist mit der Gradientenelution. Mobile Phase 1 Startpunkt mobile Phase Detektion Der mobilen Phase kann eine fluoreszierende Substanz beigegeben werden. Nach Ende des Experiments wird die DC-Platte im UV-Licht beobachtet und an Stellen, wo sich ein Analyt befindet ist die Fluoreszenz des Laufmittels verringert. Eine weitere sehr einfache und generelle Methode zum Sichtbarmachen von Substanzen auf einer DC-Platte ist das Besprühen der Platte nach dem Chromatographie-Experiment mit Schwefelsäure/Salpetersäure. Nach erhitzen auf C für weinige Minuten werden fast alle organischen Substanzen oxidiert und sind als braun/schwarze Flecken sichtbar. Die Proben können nach Ermittlung ihrer Position auf der Platte weiter analysiert werden, indem sie z.b. von der Platte gekratzt werden und mit MS, NMR oder IR weiter analysiert werden. Mit Laser-Desorptionsmethoden (kombiniert mit MS) oder Sekundärionen-MS (SIMS) kann die Platte auch direkt beprobt werden. Alle Gleichungen zur quantitativen Charakterisierungen des Chromatogramms, die in Kapitel 1 besprochen wurden, können auch auf DC-Experimente angewendet werden, wobei die Retentionszeiten (aus der Säulenchromatographie) durch Entfernungen von der Startlinie (der DC) ersetzt werden.