Relevanz von Virusvarianten für Diagnostik, Therapie und Krankheitsverlauf am Beispiel der Hepatitis B
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- Adolf Biermann
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1 Relevanz von Virusvarianten für Diagnostik, Therapie und Krankheitsverlauf am Beispiel der Hepatitis B Thomas Bock, PhD Robert Koch-Institut, Berlin FG15, Molekulare Epidemiologie viraler Erreger Bock & Zentgraf 1995 Fortbildung für den Öffentlichen Gesundheitsdienst Berlin, März 2010
2 Virus Hepatitis Hepatitis-Viren: Bock & Zentgraf 1995 Hepatitis A Virus (HAV, Picornaviren) Hepatitis B Virus (HBV, Hepadnaviren) Hepatitis C Virus (HCV, Flaviviren, Hepaciviren) Hepatitis D Virus (HDV, Viroid) Hepatitis E Virus (HEV, Caliciviren) Hepatitis G Virus (GBV-C, Flaviviren) TT-Virus (Circoviren) SENV-D/H-Virus (Circoviren) NonA-nonG Viren Andere Virusinfektionen mit Folge Hepatitis: Humanes Cytomegalie Virus (HCMV, HHV5, Beta-Herpesvirus) Herpes simplex Virus (HSV1, [HSV2], Alpha-Herpesvirus) Epstein Barr Virus (EBV, HHV4, Gamma-Herpesvirus) Gelbfieber Virus (Yellow fever virus, YFV, Flaviviren)
3 Quelle:
4 Epidemiologie der Hepatitis B Virus Infektion WHO und Robert Koch-Institut, Berlin (Epidem. Bulletin 2009, 20: ) ca. 2 Milliarden von derzeit ca. 6,5 Milliarden Menschen aktuell mit HBV infiziert > 420 Millionen Menschen = 5%-7% der Weltbevölkerung chronisch HBV infiziert > 1 Million/Jahr Todesfälle (HBV-induzierten Leberzirrhose [57% aller Fälle], hepatozellulären Karzinom (HCC) [53% aller HCC] In Europa sind zwischen <0,1% (Nordeuropa) und 8% (Ost- und Südeuropa) der Bevölkerung chronisch mit HBV infiziert In der Bundesrepublik Deutschland wurden im Jahre akuter HBV-Neuerkrankungen an das RKI gemeldet, wobei etwa 5% Virusträger bleiben
5 Hepatitis B Virus Verbreitung Quelle:
6 Pressefoto zum Start der Kampagne Hepatitis B 2009 Welt-Hepatitis Tag
7 Hepatitis B Virus Partikel im Serum virale Kopien/ml Serum (10 13 HBsAg* Partikel/ml Serum) Infektiöse HBV-Virionen Nicht-infektiöse filamentöse und globuläre HBV-Partikel (HBsAg) Bock & Zentgraf nm
8 Hepatitis B Virus LHBs Capsid HBcAg HBV DNA genome MHBs SHBs globular filamenteous SHBs SHBs Infectious virion Dane-particel (approx. 42 nm) Not-infectious HBsAg-particel (apprx. 20 nm) umhülltes ~40 nm DNA-Virus; ~20 nm Kapsid Hepadnavirus, Pararetrovirus pddna, ca bp 4 überlappende Leserahmen (ORF) prec/core, pres/surface, RT-Polymerase, X-Protein Promotoren: pg/core, S and X-Promotor; Enh 1 und Enh 2 8 Genotypen strikt hepatotroph
9 Hepatitis B Virus Genom Surface Genes HBV Virion HBV Genom Polymerase Capsidgen X-Gen nach Kann & Gerlich, 1998, modifiziert
10 Hepatitis B Virus Lebenszyklus Virion Interaktion Rezeptor? Entry cccdna Amplifikation ER Polymerase DNA (+) (+) Strang Synthese Virion Sekretion Nucleus cccdna Formation rcdna DNA (-) HBV Minichromosom (Bock et al 2001) cccdna pgrna Hepatozyte Translation Enkapsidierung Reverse Transkription virale Proteine Sekretion Transkription pgrna AAA AAA AAA AAA mrna ER Adapted from: Ganem D, et al. N Engl J Med 2004 HBeAg HBsAg
11 Übertragungswege des Hepatitis B Virus parenteral (Blut/-produkte) (Dialyse) kontaminierte Instrumente kontaminierte Spritzen sexuell perinatal Quelle:
12 Risikogruppen der Hepatitis B Virus-Infektion Heterosexuelle (Promiskuität) (41%) Drogenabhängige (15%) Homosexuelle (9%) familiärer Kontakt (2%) Heilberufe (1%) Unbekannt (31%) Quelle: CDC Sentinel Counties Study of Viral Hepatitis
13 Alterspezifische Verteilung von HBV Infektionen 14,0 gemeldete Erkrankungen/ ,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 3,9% 6,7% 25,9% 41,8% 15,3% 6,4% < >65 Altersgruppen Altersspezifische Inzidenz der Hepatitis B, Jilg; Dt. Ärzteblatt 1996
14 Klinischer Verlauf der Hepatitis B Virus Infektion HBV Infektion inapparent (65%) akut (35%) (90%-95%) fulminant (<1%) Ausheilung chronisch persistent (70%) Chronische Hepatitis (5-10%) chronisch aktiv (10%) (30%) (>50%) Zirrhose (10%) Primäres Leberkarzinom Gesunde HBsAg-Träger? tuepedia.de/index.php/ludwig_uhland
15 Inzidenz des hepatozellulären Karzinoms in Hannover / n= ,7 % Hepatitis B 13,1 % Hepatitis C 7,8% keine Risikofaktoren 7,1 %Hepatitis B und C 23,1 % Alkohol Missbrauch 0,4 % Steroid Missbrauch 0,4 % M. Wilson 0,7% Hämochromatose 15,7 % andere Leberzirrhose 3,7% Hep. C und Alkohol 6,3 % Hep. B und Alkohol 3,0 % Hep B und C und Alkohol Kubicka et al, Liver 2000; 20(4):312-8
16 Akute Hepatitis B: Diagnostik Serologie: - HBsAg, anti-hbc (total und IgM) - HBeAg, (anti-hbe) Weitere Methoden: - HBV-DNA (quantitaiv) - Transaminasen HBe/HBs Sero-conversion Ganem & Prince, 2004
17 Chronische Hepatitis B: Diagnostik Zusätzlich zur Akut-Diagnostik: - Sonographie der Leber - zusätzliche biochemische Marker (Albumin, ChE, Quick, AFP) - Ausschluss anderer Infektionen (HIV, HDV, HCV) - Leberhistologie keine HBe/HBs Sero-conversion Ganem & Prince, 2004
18 Diagnostik der HBV Infektion HBsAg positiv anti-hdv HBeAg, HBV-DNA + - (hoch-replikativ) (niedrig-replikativ) >10 5 IE/ml <10 5 IE/ml
19 HBV Viruslast und HCC-Risko kumulative Inzidenz des HCC abhängig der baseline HBV DNA (n=3851) P<0.01 Chen CJ et al. EASL 2005
20 HBV-Core-spezifische Quantitative Real Time Taqman PCR HBV qpcr Amplification Plot Kommerziell z.b.: COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test Standard Kurve
21 Weltweite HBV-Genotyp Verteilung A(e) G A G D D A(a) D C B(a) B(j) H E A C H F A(a) F F Adapted from Hamilton and Gross
22 HBV Genotypen und Suszeptibilität zu antiviralen Substanzen Interferon alpha: Genotyp A und B sprechen relativ gut an Genotyp D und C sprechen nur moderat an Lamivudine: Resistenzrate höher bei A als in D kein Unterschied zwischen B und C Adefovir: keine Genotyp-spezifischen Unterschiede andere Nukleoside: bislang nicht bestimmt
23 Methoden zur HBV Genotyp Bestimmung Variable pres/sregion zur HBV Genotypisierung
24 Therapie der chronischen Hepatitis B Virus Infektion (PEG)-Interferon-α Nucleoside Analoga (Lamivudine, Entecavir, Telbivudine) Nucleotide Analoga (Adefovir dipivoxil, Tenofovir) Hepatitis B Hyperimmunoglobulin (HBIG) Prophylaxis des Hepatozellulären Karzinoms
25 Wirkung Antiviraler Substanzen Inhibition der Reversen Transkription Inhibitoren der viralen Polymerase durch Nucleos(t)idanaloga: Herpesvirus Polymerase: Aciclovir, Ganciclovir Inhibitoren der Reversen Transcriptase: HIV: AZT (Zidovudine) HBV Polymerase: Lamivudin (Zeffix TM ) Adefovir (Hepsera TM ) Entecavir (Baraclude TM ) Telbivudine (Sebivo TM ) Tenofovir (Viread ) Adapted from: Ganem D, et al. N Engl J Med 2004 Selektion von Therapieresistenten Mutationen
26 Schema der Nucleos(t)idanalog-Wirkung Kettenabbruch wt HBV Polymerase-Funktion Nucleotidanalog-Wirkung auf die HBV Polymerase Funktion führt zu Kettenabbruch modifiziert nach: Richman, Nature 2001, 410:
27 Hepatitis B: Problem der antiviralen Resistenz Nur ein virales Target - die HBV Polymerase Nur eine Substanzklasse (Nucleos(t)id-Analoga) Antivirale Substanzen: Lamivudine / Telbivudine (L-NUCLEOSID) Adefovir / Tenofovir (ACYCLISCHES PHOSPHONAT) Entecavir (CYCLOPENTEN RING GRUPPE)
28 Selektion von Hepatitis B Virus Varianten Mutanten und Genotypen Virale Faktoren: HBV ist ein hoch replizierendes Virus (10 12 IE/ml) Die virale Polymerase (Reverse Transcriptase) besitzt keine proofing reading Aktivität 1-5 x10-5 Substitutionen/Position/Jahr (S/P/Y) = >10 7 Fehler/Tag/Patient 10 4 fach höher im Vgl. zum humanen Genom Lange Halbwertszeit der cccdna (6-10 d) Lange Halbwertszeit der infizierten Hepatozyte (>30d) Wirt Faktoren: Selektionsdruck des Immunsystems Selektionsdruck einer antiviralen Therapie Andere selektive Einflüsse Bock & Zentgraf 1995
29 Einfluss von HBV Mutanten auf die Virus Replikation Mutationen im HBV Genom führen zur: Modulation der HBV Replikation Beeinflussen die Wirtszell-Suszeptibilität Maskieren gegen das Immunsystem oder haben keinen Einfluss
30 Klinische Relevanz von HBV Mutanten Mutationen im HBV Genom können assoziiert sein mit: schweren Leberentzündungen fulminanter Hepatitis Leberzirrhose HCC (Leberzellkarzinom) Resistenz gegen eine antivirale Therapie
31 Häufige Mutationen im HBV Genom 3221/ /0 HBV Genom G1896A/C1858T prec-stopp (HBeAg neg.) Schwere Leberentzündung, Resistenz Core/HBS/X ORF prec C S-Promoters SP1 SP2 pres1pres2 P120T/D144A/G145R a Determinante Escape Mutanten S Enh I XP A1762T/G1764A HBeAg neg. Enh II X BCP M204V/I (YMDD) Lamivudine Resistenz Stopp Codon trunkiertes X-Protein HCC Assoziation K130M/V131I überlappt mit A1762/G1764A Polymerase ORF TP spacer RT RNaseH antivirale Resistenz L180M Lamivudine Resistenz A181V Adefovir Resistenz N236T Adefovir Resistenz
32 Mangelnde Suppression der viralen Replikation fördert die Selektion von resistenten Viren Behandlungsstart Therapie-suszeptibles Virus Natürlich vorkommende Virusvarianten Therapie-resistente Varianten HBV Replikation Mangelnde Suppression - Inadäquate Potenz des Medikaments - Inadäquate Medikamentenkonzentration - Inadäquate Einnahme (non compliance) - Prä-existierende HBV Resistenzmutanten Fung SK & Lok ASF. Antivir Ther 2004; 9: Locarnini S, et al. Antivir Ther 2004; 9: Time
33 Nachweis von Hepatitis B Virus Quasi-Spezies (YMDD vs YIDD) 50% YMDD/YIDD T/G 50% T-C T 10% YIDD G 10% T-C
34 Definition der Therapie-Resistenz Genotypische Resistenz: Mutationen im HBV Genom welche sich aufgrund der antiviralen Therapie entwickeln Virologischer Durchbruch: Rückfall der HBV Serum DNA Spiegel während der antiviralen Therapie Klinischer Durchbruch: Virologischer Durchbruch mit erhöhten ALT Spiegelen oder verschlechterter Histologie Phänotypische Resistenz: Verringerte Suszeptibilität (in vitro) der antiviralen Therapie assoziiert mit genotypischer Resistenz Kreuzresistenz: Virusmutanten, die durch eine Substanz selektioniert werden und auch mit einer Resistenz gegen eine andere Substanz einhergehen Cornberg, Wedemeyer et al., Z. Gastroenterologie 2007; 45:525-57
35 Definition der Therapie-Resistenz Leitlinien der Arbeitsgemeinschaft Wissenschaftlicher Medizinischer Fachgesellschaften Cornberg, Wedemeyer et al., Z. Gastroenterologie 2007; 45: Klinisch ausreichendes Ansprechen: nach 6 Monaten antiviraler Therapie ist die Viruslast unter < 200 HBV-IE/ml gesunken Primär virologisches non/bad-response: nach 3 Monaten antiviraler Therapie kein Abfall der Viruslast um mindestens >1 log Sekundäre Resistenz: nach initialem Ansprechen auf eine antivirale Behandlung konsekutiver Anstieg der Viruslast um mehr als >1 log über dem Detektionslimit
36 Entwicklung einer antiviralen Resistenz unter Nukleos(t)id-Analog Behandlung Resistenz (%) Entecavir <1% nach 1 Jahr bei unbehandelten Pat. 20% nach 2 Jahren 3 bei Lam-vorbehandelen Pat. Tenofovir 5 0% after 72 Wochen Telbivudine 4 18% Lamivudin 1 Jahr 1 Jahre 2 Jahre 3 Jahre 4 70% Adefovir 2 Jahre 5 29% 1 Lai et al. Clin Infect Dis. 2003;36: Hadziyannis et al. Gastroenterology 2006;131: , 3 Sherman et al. Hepatology Lai et al. AASLD Heathcote et al. AASLD 2007, Marcellin et al. AASLD 2007
37 Schema PCR/Sequenzierungsmethode zur Mutationsanalyse von Hepatitis B Virus Resistenzmutationen Fragment YMDD nt HBV Polymerase rtm
38 Molekulargenetische Analyse der HBV Polymerase von HBV-infizierten Patienten bei Adefovir Behandlung F/G A Polymorphe Bereiche B B C D E rta181v YMDD rtn236t rtl180m LAM/ETV rtt184g ETV rta194t TDF? rts202i rtm204v/i ETV LAM/LdT/ETV rtm250v ETV rtc256s LAM
39 Häufigkeitsverteilung von HBV Polymerase-Mutationen unter Adefovir Therapie A B C D E 1 179/1 169 F G 60 Terminal Protein Spacer Reverse Transcriptase RNaseH n=276 Patienten Anzahl Patienten aa Substitutionen Bock et al. Hepatology 2007; 46:658A
40 Polymorphe Bereiche der HBV RT-Domäne Qi et al AASLD FG A B C D E number of patients I16T L91I S106T L115V L122F N124H H126R D131N L180M A181V I187L rtv191i M204I M204V L217R V233I N236T N248H C256 W260L E263D I266R Q267M/H n=276 aa Substitution Bock et al. Hepatology 2007; 46:658A Polymorphe Bereiche Polymorphe Stellen (>1% Sequenz Variation) in der HBV RT-Domäne 59 (17%) der 344 HBV- RT Reste zeigen >1% Sequenzvariation bei HBeAg+ Patienten
41 Suszeptibilität von HBV Polymerase Mutanten gegenüber Adefovir Dipivoxil in funktionellen phänotypischen Assays 1,2 1 Wildtyp 1,20 1,00 rtn236t EC 50 = >20 µm 0,8 0,80 0,6 EC 50 =3 µm 0,60 0,4 0,40 0,2 0,20 0 control 1µM ADV 5µM ADV 10µM ADV 0,00 control 1 µm ADV 10 µm ADV 20 µm ADV 1,40 1,20 rtn248h 1,40 1,20 rtv233i 1,00 0,80 EC 50 = 12 µm 1,00 0,80 EC 50 = 16 µm 0,60 0,60 0,40 0,40 0,20 0,20 0,00 control 1 µm 10 µm 20 µm 0,00 control 1 µm ADV 10 µm ADV 20 µm ADV Bock et al. Hepatology 2007; 46:658A
42 LAM Lamivudine ETV* Entecavir Kreuzresistenz bei HBV Therapeutika 1 179/1 169FG A B C D E Terminal Protein Spacer Reverse Transcriptase RNaseH YMDD V173L L180M A181V/S A184G S202I M204I M204V N236T M250V LdT Telbivudine FTC Emtricitabine ADV Adefovir TdF tenofovir Yang H. et al. Hepatology 2003;38:705A; Lai CL et al Hepatology 2003;38:262A * ETV Resistenz benötigt YVDD Mutation
43 Selektion kompensatorischer Mutationen unter sequentieller antiviraler Behandlung
44 Selektion kompensatorischer Mutationen unter antiviraler Behandlung: Patienten Patient 1 Patient 2 Patient 3
45 Muster von HBV Polymerase Mutanten prec ATG=1 EcoR T476N 1996 G145R 2076 L528M 2148 M552V 2150 M552I 3221 phbv1.2 prec C pres1pres2 S TP spacer RT polymerase RNaseH X B-domainC-domain sg145r sp120t HBV wt adw 2 L180M (W171W) M204V (I195M) M204I (I195T) sg145r/m552i sp120t/m204i L180M/M204V S-ORF P-ORF sg145r/l528m/m204v sp120t/l180m/m204v 145 NH 2 -TGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTC - COOH a-determinant catalytic site NH 2 -NQYGTMQNLHDSCSRQLYVSLMLLYKTYGWKLHLYSHPIVLGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAICSVVRRAFPHCLAFSYMDDVVLGAK - COOH B-domain C-domain T T HBIg P120T T R R HBIg G145R R M Lam L180M M M M 552 V I I I V Lam M204V V V 560 HBIg FCV LAM
46 Sensitivität von Polymerase Mutanten gegenüber Lamivudine µm Lamivudine HBV Marker control wt phbv1.2 P120T M204V L180M/M204V P120T/L180M/M204V G145R/L180M/M204V 3.2 kb HBV Progeny DNA Lam + Lam + Lam - Keine Sensitivität - erhöhte Replikation unter LAM Behandlung control wt-hbv wt-hbv + Lam P120T/L180M/M204V P120T/L180M/M204V + Lam G145R/L180M/M204V P120T/L180M/M204V + Lam Bock et al. Gastroenterology 2002
47 Rational für eine De Novo Kombinations- Therapie Kombination von Therapeutika ohne Kreuzresistenz Drug B Resistenz Mutante Drug A Wildtyp wt Drug A Resistenz Mutante Drug B Geringes Risiko zur Selektion von MDR Clavel et al NEJM 2004;350: ; Zoulim Antiviral Res 2004;64: 1-15
48 Wege zur Resistenzvermeidung Maximieren der antiviralen Aktivität Wahl von Präparaten mit hoher antiviraler Potenz Vorgegebene Dosierung einhalten Leichte Einnahme, hohe Resorption (Nahrungsunabhängig) Für maximale Therapie-Adhärenz sorgen (Compliance) Maximieren der Resistenzbarriere Vermeidung sequentieller Monotherapie Auswahl von Nukleos(t)idanaloga mit einer hohen Resistenzbarriere Kombination komplementärer Resistenzprofile Cornberg et al. Upgrade der Leitlinie, AWMF-Register-Nr.: 021/011, Z Gastroenterol 2007;45:1-50
49 Resistenz: Zusammenfassung der Leitlinie 2007 Die neuen Leitlinien unterstreichen die Wichtigkeit der Resistenzvermeidung und adäquatem Resistenzmanagement - Bei >1 Mio Kop/ml Einsatz hochpotenter Substanzen - HBV-DNA Monitoring alle 3 Monate, Intensivierung der Therapie bei unvollständigem Ansprechen nach 6-12 Monaten - Rasche Intervention nach sekundärem Therapieversagen (>1 log Viruslastanstieg) - Vermeidung sequenzieller Monotherapie - Add-on Therapie mit komplementärem Resistenzprofil Cornberg et al. Upgrade der Leitlinie, AWMF-Register-Nr.: 021/011, Z Gastroenterol 2007;45:1-50
50 University of Tübingen Deptartment of Molecular Pathology Prof. Dr. Reinhard Kandolf Dr. Bernd Köberlein Dr. Anja Düchting Dr. Stefanie Simonovic Dipl. Biol. Agnes Bryniok Dipl. Biol. Friedericke Utta cand. med. Christine Walker cand. med. Martin Wolf cand. med. Christian Wollboldt Rosa Mamato Heike Kaiser Duke University, Durham, USA Prof. Dr. Hans Tillmann Acknowledgments Medical School of Hannover Prof. Dr. Heiner Wedemeyer Prof. Dr. Michael Manns Charitè Universitätsmedizin Berlin, Bemjamin Franklin, Virchow Prof. Dr. Thomas Berg Prof. Dr. Carsten Tschöpe German Cancer Research Center, DKFZ, Heidelberg Prof. Dr. Hanswalter Zentgraf Prof. Dr. Frank Rösl Albert Schweitzer Hospital, Lambarene, Gabon Prof. Dr. Peter Kremsner Tran Hung Dao Hospital, Hanoi, Viet Nam Prof. Dr. Nguyen T. Binh Dr. Song Le Huu Dr. Nguyen Toan Robert Koch-Institut, FG15: Dr. Marina Höhne Dr. Sabine Diedrich Dr. Meike Chevillotte Dr. Sandra Niendorf Dr. Andreas Mas Marques Fr. Tina Dittmann Fr. Daniela Gutt Fr. Roswitha Lorenz Fr. Ute Obst Fr. Christin Kellner Fr. Kathrin Stanossek Fr. Jenny Thiele Fr. Sonja Zimmermann Royal Melbourne Hospital, Australia Prof. Dr. Joseph Torresi Prof. Dr. Stephen Locarnini
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