3. Methoden Molekularbiologische Methoden Molekularbiologische Standardmethoden

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1 3. Methoden 3.1. Molekularbiologische Methoden Molekularbiologische Standardmethoden Alle nicht im Einzelnen aufgeführten molekularbiologischen Standardmethoden wurden nach Ausubel et al oder nach Sambrook et al durchgeführt. Weiterführende Techniken sind im Folgenden kurz beschrieben RNA-Isolation mittels Trizol Die Gesamt-RNA-Isolierung aus Zellen erfolgte mittels der Trizol-Methode, modifiziert nach Chomczynski (Chomczynski et al., 1993). Die zu untersuchenden Zellen wurden mit 1 PBS gewaschen, um Reste des Mediums zu entfernen. Anschließend wurden 1-2 ml Trizol pro 10-cm-Platte zugegeben und die sich ablösenden Zellen in ein bis zwei 1,5 ml-tubes gegeben. Es erfolgte eine Inkubation von 5 min. bei 30 C. Zu den lysierten Zellen wurde 0,2 ml Chloroform/ml Trizol zugegeben. Die Tubes wurden für 15 sek. vorsichtig geschüttelt und 3 min. bei 30 C inkubiert. Nach einer 15 minütigen Zentrifugation erhielt man drei Phasen: die obere farblose Phase, in der sich die Gesamt-RNA befindet, eine mittlere Interphase, die Proteine enthält und eine untere Phenol/Chloroform-Phase. Die obere Phase wurde abgenommen und die RNA mit 0,5 ml Isopropanol gefällt. Nach einer Zentrifugation bei g wurde die RNA mit 75% Ethanol/DEPC-H 2 O gewaschen, 10 min. getrocknet und in H 2 O gelöst. Um den Abbau der RNA durch RNAsen zu verhindern, wurde 1µl RNASIN (40 units/µl) zugegeben. Um einer Kontamination der RNA mit genomischer DNA vorzubeugen, wurde ein DNA-Verdau durchgeführt. Dazu wurde folgender Ansatz pipettiert. 10 µg Total-RNA 6 µl 10 DNASE-Puffer 5 µl DNASE ad 60 µl H 2 O Der Ansatz wurde bei 37 C 40 min. inkubiert. Es folgte eine anschließende Hitzeinaktivierung bei 65 C für 15 Minuten. Die Reinigung der RNA erfolgte durch eine Chloroform/Phenol-Extraktion mit einer anschliessenden LiCl- Fällung. 21

2 Die mrna-isolation für die Vorhaut-Fibroblasten erfolgte mittels eines Micro-Fast-TrackmRNA-Isolations-Kits von Invitrogen Methoden der Polymerase-Ketten-Reaktion RT-PCR Die Transkription der RNA in cdna erfolgte durch eine RNA-abhängige DNA-Polymerase. Ansatz: 2 µg Total-RNA 4 µl 5 Puffer 2 µl 100 mm DTT 2 µl dntps (10mM) 0,5 µl Rnasin (40U/µl) 1µl Reverse Transkriptase (50U/µl) Anschließend wurde die RNA durch Zugabe von 1µl RNASE verdaut Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels der Polymerase Kettenreaktion (PCR) Für die PCR mit cdna wurde folgender Ansatz zusammenpipettiert: x µl cdna 1µl pro Oliginucleotid-Primer (10mmolar) 4 µl dntps ( 2,5mmolar) 4µl 10 Taq-Puffer 8µl Enhancer 0,2 µl Taq (5U/µl) ad 40 µl Aqua bidest Die PCR-Zyklen wurden wie folgt programmiert: Prädenaturierung 95 C bei 5 min. Denaturierung 95 C bei 1 min. Annealing x C bei 1min Extension 72 C bei 1 min. 22

3 Nach dem letzten Zyklus folgten weitere 5-10 min. bei 72 C. Die Annealing-Temperatur x liegt bei ±5 C von der Schmelztemperatur (T d ) der verwendeten Primer. Diese errechnet sich nach der 2-4 -Regel, wobei für A und T 2 C und für G und C 4 C gerechnet werden. In Fällen bei denen die Primer unspezifisch gebunden haben, wurde die Annealing-Temperatur durch einen Temperatur-Gradienten optimiert. Die verschiedenen Annealing-Temperaturen sind in einer Tabelle im Material-Teil zusammengefasst. Die PCR-Produkte wurden auf ein 2%-iges Agarose-Gel durch Gelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und mittels einer Gel-Dokumentationsanlage aufgenommen Sequenzierungen Die PCR-Fragmente wurden aus dem Agarose-Gel ausgeschnitten und die DNA mit einem QlAquick-Gel-Extraktions-Kit eluiert. Die Sequenzierung erfolgte auf der Grundlage des Kettenabbruchverfahrens (Sanger et al., 1977; Tabor und Richardson, 1987). Die Sequenzreaktion wurde mit dem Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequenzing Kit und den jeweiligen 5`sense-Primern, die nach der RT-PCR zur Erhaltung des Produktes verwendet wurden, durchgeführt. Die Sequenzanalyse erfolgte am Gerät ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). Die erhaltenen Sequenzen wurden über Blast search (Altschul et al., 1997) mit schon vorhandenen Einträgen verglichen Methoden der Zellkultur Isolation von primären Zellen Isolation von humanen Knochenmarkzellen aus dem Hüftgelenkskopf Humane mesenchymale Knochenmarkszellen wurden mit einer 21-gauge-Nadel mit 100 ml GM-HMSC aus dem Hüftgelenkskopf verschiedener Spender (50-80 Jahre alt) ausgespült, durch ein Zellsieb mit dem Porendurchmesser von 100µm gesiebt, auf mehrere 50-ml- Falkon-Röhrchen verteilt und bei 1000 rpm 5 min. zentrifugiert. Das Pellet wurde in 5 ml Medium aufgenommen und auf mehrere 30-cm-Platten sehr dicht ausplattiert. Um Fibroblasten aus der Kultur zu entfernen, wurden die Zellen präplattiert. Dazu wurde nach einem Tag der Überstand abgenommen und auf eine neue 30-cm Platte ausplattiert. Zwei bis drei Tage später, nach dem sich die ersten Zellen absetzten, wurde der Überstand, in dem sich Erythrozyten und hämatopoetische Stammzellen befinden, abgenommen und 23

4 verworfen. Das Medium wurde täglich gewechselt, bis die Zellen eine Konfluenz von 60-70% erreicht hatten. Die Zellen wurden durch Trypsinisieren 1:2 gesplittet. Nach Erreichen der 3. Passage wurden sie trypsinisiert und in einer DMSO-Gefrierlösung aufgenommen und weggestockt oder für Experimente verwendet. Weiterhin wurden für vergleichende Experimente humane mesenchymale Stammzellen bei der Firma CellSystems käuflich erworben und durch die Universitäts-Kinderklinik bereitgestellt Isolation von Satelliten-Zellen Die Hinterbeinmuskulatur wurde von 2 ICR-Mäusen herauspräpariert, mit einem Skalpell zerkleinert und 1h bei 37 C unter ständigem Rühren mit einer Protease-Lösung, die 1:10 von der Stocklösung verdünnt wurde, verdaut. Anschließend wurden die angedauten Muskelstückchen mit einer Pipette homogenisiert, durch einen Filter (100µm Porendurchmesser) gegeben, in GM-SZ aufgenommen, bei 1000 rpm 10 min. zentrifugiert und in ein 15ml-Röhrchen mit einem Percoll-Gradienten (1,131g/ml), der 3 Konzentrationen (75%; 50%; 25%) enthält, gegeben. Die Zellen wurden bei 1250 g für 20 min. zentrifugiert. Die erste Interphase enthält Satellitenzellen und Fibroblasten und ist deshalb ungeeignet für weiterführende Experimente. Die zweite Interphase, die zu 99% Satellitenzellen enthält wurde mit einer 21-gauge-Nadel abgezogen. Die Zellen wurden in ein neues 15 ml- Röhrchen, das 5 ml SZ-GM enthält, gegeben, 5 min. bei 1000 rpm zentrifugiert und anschließend auf zwei 6-well-Platten ausplattiert. Nach 3 Tagen erfolgte der erste Mediumwechsel DiI-Markierung der HMSC Die HMSC wurden nach Erreichen einer Konfluenz von 80% mit 1 PBS gewaschen und nach Zugabe der DiI-Lösung 5 min bei 37 C inkubiert. Anschliessend wurden die Zellen bei 4 C 15 min. belassen. Nach 2-maligem Waschen der Zellen mit 1 PBS wurde der Erfolg der Färbung durch das Fluoreszenzmikroskop geprüft Kryoschädigung und Injektion von DiI-markierten HMSC Für diesen operativen Eingriff wurden Scid-Mäuse verwendet, da aufgrund ihres defekten Immunsystems keine Abstoßung der HMSC möglich ist. Die Anästhesie der Mäuse erfolgte durch Avertin. An dem rechten Oberschenkel wurde ein kleiner Schnitt gesetzt. Der darunter liegende Muskel wurde mit einer in flüssigen Stickstoff erkalteten Pinzette gequetscht. 24

5 Anschließend wurden die DiI-markierten HMSC ( Zellen/50µl) in das Gebiet der Verletzung mit einer Hämilthon-Spritze hineingespritzt. Die Wunde wurde mit einem chirurgischen Nahtmaterial genäht. Nach 14 Tagen erfolgte die Präparation des geschädigten Muskelgewebes Generation und Analyse von chimären Mäusen Adulte mesenchymale Stammzellen wurden aus dem Knochenmark von MLC1/3-LacZ- Mäuse isoliert (Belema-Bedada et al., in Revision). Die Blastozysten-Injektion wurde von Prof. Dr. Dr. Braun durchgeführt. Es wurden Blastozysten von C57/BL6, NFATC2 -/- und NFATC2 -/- C3 -/- wie beschrieben isoliert (Braun et al., 1992; Braun and Arnold 1995) adulte mesenchymale Stammzellen wurden pro Blastozyste injiziert. Die Blastozysten wurden zur weiteren Entwicklung in Ammenmütter transplantiert. Nach Erreichen der Embryonal-stadien 10,5d bis 14,5d wurden die Embryonen präpariert (3.2.5.) und mittels einer ß-Galaktosidase-Färbung und PCR analysiert. Die NFATC2 -/- -Mäuse und NFATC2 -/- C3 -/- -Mäuse wurden uns von Prof. Edgar Serfling (Universität von Würzburg) zur Verfügung gestellt. Zur Kontrolle wurde der Dottersack der Embryonen mittels PCR mit spezifischen Primern (siehe ) genotypisiert Präparation von Embryonen Die Ammenmütter wurden durch einen medianen Schnitt geöffnet und die Uteri heraus präpariert. Die Embryonen wurden aus den Uteri in PBS vorsichtig präpariert und in 4%PFA über Nacht fixiert. Nach anschließendem Waschen mit 1 PBS wurden sie nochmals über Nacht in Saccharose/PBS bei 4 C inkubiert Einbettung der Embryonen mittels Agarose Die Embryonen wurden in eine 2%-ige 40 C warme Agarose/PBS-Lösung eingebettet. Die Einbettung erfolgte in 2cm 3 -große Förmchen. Die Embryonen wurden in der Einbettungsform ausgerichtet und mit der Agarose-Lösung überschichtet. Nach Aushärten der Agarose wurden die Blöckchen 30-50µm dick mittels eines Vibratoms (VT 1000 E; Leica) geschnitten. Eine kurze Inkubation in PBS diente zum Ausbreiten der Schnitte, die anschliessend auf Objektträger überführt wurden. 25

6 Kryotomschnitte von Geweben Das Gewebe wurden in 1 PBS präpariert und gewaschen. Anschließend wurde das Muskelgewebe über Nacht in 30%-iger Saccharose/PBS inkubiert. Die Fixierung der Muskelschnitte mit 4%-igen PFA/PBS erfolgte erst auf den Schnitten (siehe ). Das Muskelgewebe wurde in OCT-Einbettungsmedium auf Trockeneis eingebettet. Die gefrorenen OCT-Blöcke wurden mit einem Kryotom der Firma Leica geschnitten. Von dem Muskelgewebe wurden 15µm dicke Schnitte angefertigt. Die Schnitte wurden auf mit Vectabond-beschichtete Objektträger aufgebracht, 4h bei Raumtemperatur getrocknet und bei -20 C aufbewahrt Differenzierungsassays Für die Differenzierungsassays wurden HMSC der 2. Passage verwendet Adipogene Differenzierung Die humanen mesenchymalen Stammzellen wurden auf 10-cm Platten ausplattiert und bis zu einer Konfluenz von 80% in GM-HMSC kultiviert. Anschließend wurde die adipogene Differenzierung durch Wechseln des Wachstumsmediums zum Differenzierungsmedium eingeleitet. Das Differenzierungsmedium wurde aller 3 Tage zur Hälfte gegen neues Medium ausgetauscht. Nach 7 Tagen wurde eine Oil-Red-Färbung durchgeführt, um Lipidtröpfchen zu färben Osteogene Differenzierung Die HMSC wurden ebenfalls in GM-HMSC kultiviert (wie oben beschrieben) und zur Differenzierung im osteogenen Differenzierungsmedium kultiviert. Nach 14 Tagen wurde das intrazelluläre Kalzium durch eine von-kossa -Färbelösung detektiert Chondrogene Differenzierung Die HMSC wurden bis zu einer Dichte von 80% kultiviert und anschließend in einem chondrogenen Differenzierungsmedium kultiviert. Das Medium wurde wie in den oben beschriebenen Differenzierungsassays nach 3 Tagen zur Hälfte erneuert. Nach 14 Tagen wurde eine Safranin-O-Färbung durchgeführt. 26

7 Zusätzlich wurde die RNA der differenzierten Zellen isoliert und eine RT-PCR durchgeführt, um die jeweilige Differenzierung an Hand der Expression von Differenzierungsmarkern (ap2, ür die Fettdifferenzierung, Osteogenin für die osteogene Differenzierung und Sox9 und Aggrecan für die chondrogene Differenzierung) zu untermauern Infektion der humanen mesenchymalen Stammzellen mit GFP-exprimierenden Adenoviren Die Zellen wurden mit den Adenoviren (40µl/10 8 pfu/2ml Medium ohne Zusätze), die durch einen Viruspromotor GFP exprimieren (Adeasy-GFP), 1h infiziert. Dabei wurde die Platte aller 15 min. geschwenkt. Anschießend wurden sie mit 1 PBS gewaschen und in GM-HMSC inkubiert Kokultivierungsexperiment HMSC wurden auf einer 10-cm-Platte ausplattiert. Die Zellen wurden mit dem Adaesy-GFP infiziert. C2C12-Zellen wurden ebenfalls auf einer 10-cm-Platte ausplattiert und bis zu einer Dichte von 80% kultiviert. Anschießend wurden die infizierten HMSC trypsinisiert und zu den C2C12-Zellen zugegeben. Vierundzwanzig Stunden später wurde das Medium zum Differenzierungsmedium (DM-C2C12) gewechselt. Nach 5-6 Tagen erfolgte eine histochemische Färbung mit Antikörpern oder eine RNA-Isolation Kokultivierungsexperiment mit Zugabe von Zytokinen oder Antikörpern. HMSC wurden, wie oben beschrieben, mit dem Adeasy-GFP infiziert und mit nicht markierten C2C12-Zellen in 6-well-Platten kultiviert. Zum Differenzierungsmedium wurden verschiedene Konzentrationen des Zytokins IL-4 und verschiedene Konzentrationen der Antikörper gegen den humanen IL-4-Rezeptor und endogen-exprimiertes IL-4 der C2C12- Zellen zugegeben: Well 1: Il-4 (5ng/ml) Well 2: Il-4-Ab (6µg/ml) Well 3: Il-4-R-Ab (5ng/ml) Well 4: Il-4-R-Ab (50ng/ml) Well 5: K w/o 27

8 Nach 6 Tagen erfolgte eine Antikörperfärbung mit dem Erst-Antikörper MF20, welcher an die schwere Kette von Myosin bindet Kokultivierungsexperiment mit Polykarbonat-Filtermembranen Für das Filterexperiment wurden Polycarbonat-Filtermembranen mit verschiedenen Porengrößen (0,3µm; 4,0µm; 8,0µm) verwendet. Der Filter wurde verkehrt herum in ein Well einer 6-Well-Platte gestellt und auf der Filtermembran wurden C2C12-Zellen ausplattiert. Nach 4h wurde der Filter umgedreht. In die innere Seite wurden die Adeasy-GFP-infizierten HMSC plattiert und über Nacht in GM-HMSC inkubiert. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen durch das Differenzierungsmedium zur Differenzierung gebracht. Die Antikörperfärbung und Kernfärbung wurde wie in den nächsten Abschnitten und durchgeführt Immunhistochemische und histochemische Färbungen Immunhistochemische Färbung von Zellen und Gewebeschnitten Die Zellen und Gewebeschnitte wurden mit 1 PBS gewaschen und mit einer 4% PFA- Lösung 30 min. fixiert. Anschließend wurden die Zellen 3 mit PBT gewaschen. Unspezifische Bindungen des 1. Antikörpers wurden durch die Inkubation der Zellen mit 5% Pferde-Serum/PBT verhindert. Die Inkubation des 1. Antikörpers erfolgte über Nacht bei 4 C. Um den 1. Antikörper (Ak) zu entfernen wurden die Zellen in einer 0,3%-igen BSA/PBT- Lösung 3 gewaschen, und bei Raumtemperatur für 1h mit dem 2. Ak inkubiert. Mittels des Fluoreszensmikroskopes konnten die positiven Zellen in den verschiedenen Kanälen detektiert werden Doppelfärbung der chimären Myotuben mit zwei anti-maus-antikörpern Bei der anti-vimentin-ak und MF20-Ak-Doppel-Färbung wurden die Zellen nach Färben des anti-vimentin-ak mit dem sekundären Fluoreszenz-Ak, zusätzlich mit einem Maus-IgG- Antikörper inkubiert, um noch freie Bindungen des anti-vimentin-ak abzusättigen und eine unspezifische Bindung des sekundären blau-fluoresziernden Antikörpers, der an MF20 binden sollte, zu verhindern. 28

9 Färbung der Zellkerne Nach der Antikörperfärbung wurden die Kerne der Zellen mittels DAPI oder Höchst sichtbar gemacht. Die Zellen wurden in einer DAPI-Lösung oder einer Höchst Lösung 5 min. inkubiert und anschließend mehrmals mit 1 PBS gewaschen. DAPI und Höchst binden an AT-reiche Regionen der DNA. Die Fluorophore werden mit Licht der Wellenlänge nm angeregt und haben ein Fluoreszenzmaximum bei 460nm DAB-Färbung Die Zellen wurden wie oben beschrieben mit dem 1. AK über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden sie drei mal mit einer 0,3%-igen BSA/PBT-Lösung gewaschen und mit dem biotinylierten 2. Ak 1h inkubiert. Nach erneutem Waschen der Zellen folgte die Inkubation mit dem AB-Komplex der einen Avidin-Peroxidase-Komplex enthält, welcher an das Biotin bindet. Nach dreimaligem Waschen in der BSA/PBT-Lösung und zweimaligem Waschen in PBS wurden die Zellen mit einer DAB-Lösung 5 min. inkubiert Oil-Red-Färbung Die Zellen wurden mit 1 PBS gewaschen und für 20 min. in 4%-iger PFA/PBS-Lösung fixiert. Um Lipidtröpfchen der Fettzellen sichtbar zu machen, wurden die Zellen 1h bei RT mit einer Oil-Red-Lösung inkubiert. Die Lipidtröpfchen wurden rot sichtbar. Bei sehr stark differenzierten Zellen färbten sich die Lipidtröpchen rot-schwarz und bildeten einen kolloidalen Niederschlag von Kossa -Färbung Die Zellen wurden nach Induktion der osteogenen Differenzierung ebenfalls wie oben beschrieben fixiert und in der von Kossa-Färbung inkubiert. Nach einer halben Stunde wurden die Kalzium-Ionen als schwarze Punkte sichtbar Safranin-O-Färbung Die Zellen wurden mit 1 PBS gewaschen und 20 min mit 4% PFA fixiert. Nach weiterem 3- maligem Waschen wurden die Zellen 5 min. in der 1%-igen Safranin-O-Färbelösung inkubiert. Safranin-O bindet an die Glycosaminoglycane der Knorpelzellen. Anschliessend wurden die Zellen wieder gewaschen, um nicht gebundenes Safranin-O zu entfernen. 29

10 ß-Galactosidase-Färbung Die Embryonen wurden mit Lösung A (3 ) gewaschen. Anschließend wurden sie 15 min. in Lösung B zur fixiert. Es folgten 3 5-minütige Waschschritte (3 ) mit Lösung C. Die Anfärbung erfolgte über Nacht bei 4 C im Dunkeln mit Lösung D. Die Embryonen wurden wieder mit Lösung C (3 ) gewaschen und photographiert Photodokumentation Die Embryonen wurden in eine mit 1%-iger Agarose gefüllte Petrischale gelegt und mit 1 PBS überschichtet. Mittels eines Binokulars (Zeiss) wurden die Embryos nach Ausrichtung vergrößert und mit einer Digitalkamera (Nikon) aufgenommen. Die Schnitte und Zellen wurden durch das Mikroskop Axiophot II vergrößert und ebenfalls mit der Digitalkamera aufgenommen. Für die Fluoreszenzbilder wurden die Zellen und Schnitte mit unterschiedlichen Wellenlängen, die durch verschiedene Filter erreicht wurden, angeregt Statistische Auswertung Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Statistikprogramm WinSTAT. Die Graphiken wurden mit Excel erstellt. 30