Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung... 1 1.1 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren... 3 1.1.1 Klassifizierung und Struktur von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren... 6 1.1.2 Purinerge Rezeptoren... 12 1.1.3 Pharmazeutische Bedeutung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren.. 14 1.1.4 Di- und Oligomerisierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren... 15 1.2 Adenosin-Rezeptoren... 25 1.2.1 Physiologische Funktionen von Adenosin-Rezeptoren... 25 1.2.2 Pharmazeutische Bedeutung von Adenosin-Rezeptoren... 30 1.2.3 Liganden und Ligandenbindungsstellen der Adenosin-A 2A -... und -A 2B -Rezeptoren... 34 1.2.4 Di- und Oligomerisierung von Adenosin-Rezeptoren... 41 1.3 Ziele der Arbeit... 47 I
2 Methoden... 49 2.1 Charakterisierung der zweiten extrazellulären Schleife des humanen... Adenosin-A 2B -Rezeptors... 51 2.1.1 Austausch der zweiten extrazellulären Schleife des humanen... Adenosin-A 2B -Rezeptors und Expression in CHO-Zellen... 53 2.1.2 Kompetitionsexperimente... 57 2.1.3 Funktionelle Experimente: camp-akkumulation... 59 2.1.4 Computermodell der ha 2B (EL2-hA 2A )-Rezeptor-Mutante... 60 2.2 Homodimerisierung von humanen Adenosin-A 2B -Rezeptoren... 61 2.2.1 Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer... 61 2.2.2 Verdrängungsexperimente... 69 2.2.3 Einfluss von Liganden auf die Homodimerisierung... 70 2.2.4 Einfluss der M198A-Mutation auf die Adenosin-A 2B -... Homodimerisierung... 70 2.2.5 Computermodell des Adenosin-A 2B -Rezeptor-Homodimers... 70 2.3 Heterodimerisierung von humanen Adenosin-A 2A - und... -A 2B -Rezeptoren... 71 2.3.1 Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer... 71 2.3.2 Verdrängungsexperimente... 71 2.3.3 Einfluss von Liganden auf die Heterodimerisierung... 71 2.3.4 Konfokale Mikroskopie... 71 2.3.5 Computermodell des Adenosin-A 2A -A 2B -Rezeptor Heterodimers... 71 2.4 Oligomerisierung von Adenosin-Rezeptoren:... Elektrophorese-Experimente... 72 2.4.1 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 75 2.4.2 Blaue Native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 76 II
3 Ergebnisse... 79 3.1 Charakterisierung der zweiten extrazellulären Schleife des humanen... Adenosin-A 2B -Rezeptors... 81 3.1.1 Austausch der zweiten extrazellulären Schleife des humanen... Adenosin-A 2B -Rezeptors und Expression in CHO-Zellen... 81 3.1.2 Kompetitionsexperimente... 84 3.1.3 Funktionelle Experimente: camp-akkumulation... 89 3.1.4 Computermodell der ha 2B (EL2-hA 2A )-Rezeptor-Mutante... 94 3.2 Homodimerisierung von humanen Adenosin-A 2B -Rezeptoren... 96 3.2.1 Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer... 96 3.2.2 Verdrängungsexperimente... 100 3.2.3 Einfluss von Liganden auf die Homodimerisierung... 102 3.2.4 Einfluss der M198A-Mutation auf die Adenosin-A 2B -... Homodimerisierung... 103 3.2.5 Computermodell des Adenosin-A 2B -Rezeptor-Homodimers... 104 3.3 Heterodimerisierung von humanen Adenosin-A 2A - und... -A 2B -Rezeptoren... 106 3.3.1 Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer... 106 3.3.2 Verdrängungsexperimente... 107 3.3.3 Einfluss von Liganden auf die Heterodimerisierung... 109 3.3.4 Konfokale Mikroskopie... 110 3.3.5 Computermodell des Adenosin-A 2A -A 2B -Rezeptor Heterodimers... 111 3.4 Oligomerisierung von Adenosin-Rezeptoren:... Elektrophorese-Experimente... 113 3.4.1 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 113 3.4.2 Blaue Native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 117 III
4 Diskussion... 119 4.1 Charakterisierung der zweiten extrazellulären Schleife des humanen... Adenosin-A 2B -Rezeptors... 121 4.1.1 Austausch der zweiten extrazellulären Schleife des humanen... Adenosin-A 2B -Rezeptors und Expression in CHO-Zellen... 121 4.1.2 Kompetitionsexperimente... 121 4.1.3 Funktionelle Experimente: camp-akkumulation... 123 4.1.4 Computermodell der ha 2B (EL2-hA 2A )-Rezeptor-Mutante... 124 4.1.5 Zusammenfassende Diskussion... 125 4.2 Homodimerisierung von humanen Adenosin-A 2B -Rezeptoren... 127 4.2.1 Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer... 127 4.2.2 Verdrängungsexperimente... 129 4.2.3 Einfluss von Liganden auf die Homodimerisierung... 130 4.2.4 Einfluss der M198A-Mutation auf die Adenosin-A 2B -... Homodimerisierung... 131 4.2.5 Computermodell des Adenosin-A 2B -Rezeptor-Homodimers... 132 4.2.6 Zusammenfassende Diskussion... 133 4.3 Heterodimerisierung von humanen Adenosin-A 2A - und... -A 2B -Rezeptoren... 134 4.3.1 Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer... 134 4.3.2 Verdrängungsexperimente... 135 4.3.3 Einfluss von Liganden auf die Heterodimerisierung... 135 4.3.4 Konfokale Mikroskopie... 136 4.3.5 Computermodell des Adenosin-A 2A -A 2B -Rezeptor Heterodimers... 136 4.3.6 Zusammenfassende Diskussion... 137 4.4 Oligomerisierung von Adenosin-Rezeptoren:... Elektrophorese-Experimente... 138 4.4.1 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 138 4.4.2 Blaue Native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 139 4.4.3 Zusammenfassende Diskussion... 140 IV
5 Zusammenfassung und Ausblick... 141 6 Experimenteller Teil... 147 6.1 Allgemeine Angaben... 149 6.1.1 Geräte und Materialien... 149 6.1.2 Chemikalien... 153 6.1.3 Kits... 156 6.1.4 Radioliganden... 156 6.1.5 Antikörper... 156 6.1.6 Zelllinien... 157 6.2 Puffer und Lösungen... 157 6.2.1 Lösungen für die Molekularbiologie... 157 6.2.2 Lösungen für die Zellkultur... 158 6.2.3 Lösungen für die Membranpräparation... 159 6.2.4 Lösungen für die Proteinbestimmung... 159 6.2.5 Puffer für Radioligand-Bindungsstudien... 160 6.2.6 Puffer für funktionelle camp-experimente... 161 6.2.7 Puffer für Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer-... Experimente... 161 6.2.8 Puffer und Lösungen für die Immunzytochemie... 162 6.2.9 Puffer und Lösungen für die Oozyten... 163 6.2.10 Puffer und Lösungen für... Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 165 6.2.11 Puffer und Lösungen für die Blaue Native... Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 165 6.2.12 Puffer und Lösungen für den Western Blot... 166 6.3 Molekularbiologische Experimente... 167 6.3.1 Vektorkarten... 167 6.3.2 cdna... 168 6.3.3 Primer... 169 6.3.4 Sequenzierungsprimer... 171 6.3.5 Enzyme... 172 V
6.3.6 Polymerase-Kettenreaktion... 174 6.3.7 Agarose-Gelelektrophorese für DNA... 174 6.3.8 Extraktion von DNA aus dem Agarosegel... 174 6.3.9 Restriktionsverdau... 175 6.3.10 Restriktionsverdau methylierter DNA... 175 6.3.11 Ligation mit T4-DNA-Ligase... 176 6.3.12 Transformation in Escherichia coli... 176 6.3.13 Retransformation... 177 6.3.14 Selektion und Kultivierung von Bakterien-Monoklonen... 177 6.3.15 Glycerinkulturen... 177 6.3.16 Mini-/Midi-/Maxipräparation von DNA... 177 6.3.17 Konzentrationsbestimmung von DNA... 177 6.3.18 Sequenzierung... 177 6.3.19 Austausch der zweiten extrazellulären Schleife des A 2B -Rezeptors... mittels Overlap-Extension... 178 6.3.20 Klonierung von Rezeptor-DNA in einen Vektor... 179 6.3.21 Mutagenese von M198A in den humanen A 2B -Rezeptor... 180 6.3.22 Klonierung von Erkennungssequenzen an Rezeptor-DNA... 181 6.3.23 Linearisierung von DNA für die RNA Synthese... 182 6.3.24 RNA-Synthese... 182 6.3.25 Agarose-Gelelektrophorese für RNA... 183 6.3.26 Konzentrationsbestimmung von RNA... 183 6.4 Zellkultur... 184 6.4.1 Medien... 184 6.4.2 Auftauen von Zellen... 185 6.4.3 Kultivierung von Zellen... 186 6.4.4 Zellzahlbestimmung... 186 6.4.5 Einfrieren von Zellen... 186 6.4.6 Retrovirale Transfektion... 187 6.4.7 Transiente Transfektion... 188 6.5 Membranpräparation... 188 6.6 Gewinnung von camp-bindeprotein... 189 VI
6.7 Proteinbestimmung... 189 6.7.1 Proteinbestimmung nach Lowry... 189 6.7.2 Proteinbestimmung nach Bradford... 191 6.8 Kompetitionsexperimente... 191 6.8.1 Radioligand-Bindungsstudien an Adenosin-A 2B -Rezeptoren... 191 6.8.2 Radioligand-Bindungsstudien an Adenosin-A 2A -Rezeptoren... 192 6.9 Funktionelle camp-experimente... 193 6.10 Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer... 196 6.10.1 Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Experimente... 196 6.10.2 Verdrängungsexperimente... 197 6.10.3 Einfluss von Liganden... 198 6.10.4 Immunzytochemie... 198 6.11 Oozyten... 199 6.11.1 Gewinnung von Oozyten aus Xenopus laevis... 199 6.11.2 Injektion von RNA in Oozyten... 200 6.11.3 Metabolische Markierung mit [ 35 S]Methionin... 200 6.11.4 Markierung mit Cy3 oder Cy5... 200 6.11.5 Aufbereitung der Oozyten... 201 6.11.6 Aufreinigung über His-markierte Proteine... 201 6.12 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 202 6.13 Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 203 6.14 Western Blot... 204 7 Abkürzungsverzeichnis... 205 7.1 Allgemeine Abkürzungen... 207 7.2 Abkürzungen von Aminosäuren... 211 8 Literaturverzeichnis... 213 VII