und dem Institut für Medizinische Virologie des Fachbereichs Humanmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuer: Prof. Dr. W. H.

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1 Aus der Klinik für Vögel, Reptilien, Amphibien und Fische des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuer: Prof. Dr. E. F. Kaleta und dem Institut für Medizinische Virologie des Fachbereichs Humanmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuer: Prof. Dr. W. H. Gerlich Replikation von drei Säuger-Hepadnaviren im Amerikanischen Waldmurmeltier (Marmota monax) und Expression der viralen Oberflächenproteine in transgenen Pflanzen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen eingereicht von HEIKE LORENZ Tierärztin aus Hoyerswerda Gießen 2006

2 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Geschichtliche Einleitung Die Virusfamilie Hepadnaviridae Morphologie und Struktur des Virus Genomstruktur Infektion durch das Hepatitis B Virus des Menschen Epidemiologie und Übertragung Klinischer Verlauf Pathogenese, Immunantwort und Eliminierung des Virus Prävention und Therapie Tiermodelle für die Hepatitis B Infektion des Menschen Die WHV Infektion bei Woodchucks Das Ground Squirrel- und Arctic Squirrel Hepatitis Virus 12 (GSHV, ASHV) Die DHBV Infektion bei Enten Verwendung transgener Pflanzen zur Produktion essba- 14 rer Impfstoffe Integration von Fremd-DNA in das Genom der Pflanze Ziele und Ansätze dieser Arbeit 18 2 Material Laborgeräte und Verbrauchsmaterialien Chemikalien Enzyme Plasmide und Bakterienstämme Antikörper und Antiseren Primer und Hybridisierungssonden (Hybprobes) all ortho-primer und -Hybprobes Primer für die präs1-sequenzierung von ASHV und 23 GSHV Primer und Nukleotide für die Klonierung der SWHs-, 23 MWHs- und LWHs-Gene I

3 2.6.4 Primer für die Sequenzierung der SWHs-, MWHs- und 24 LWHs-Gene 2.7 DNA- und Protein-Längenstandards Kommerzielle Reaktionssysteme Puffer, Lösungen und Medien 25 3 Methoden Experimentelle Infektion von adulten Amerikanischen 28 Waldmurmeltieren (Woodchucks) mit Woodchuck-, Ground Squirrel- und Arctic Squirrel Hepatitis Virus (WHV, GSHV, ASHV) Quantitative Bestimmung der Virus-DNA mittels real-time 28 PCR (LightCycler) Prinzip der real-time PCR (LightCycler) Spezifität der Primer und Hybridisierungssonden 30 (Hybprobes) Isolierung der Virus-DNA aus Serum Durchführung der PCR Agarose-Gelelektrophorese der PCR-Produkte Quantitative Bestimmung des Oberflächenantigens mit 32 Hilfe der Laurell-Elektrophorese Prinzip der Laurell-Elektrophorese 32 ZA.2.2 Durchführung der Laurell-Elektrophorese Quantitative Bestimmung des Oberflächenantigens in 35 den Seren der mit WHV, GSHV und ASHV inokulierten Woodchucks Präzipitation und Detektion von Oberflächenantigen- 36 Immunkomplexen Isolierung von subviralen Partikeln (WHsAg, GSHsAg, 36 ASHsAg) aus Serum Zentrifugation des Serums durch ein Saccharose-Kissen CsCI-Dichtegradientenzentrifugation Fraktionierung des CsCI-Gradienten Ultrafiltration 38 II

4 3.1.5 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese(SDS-PAGE) Silberfärbung von SDS-Gelen Detektion von Proteinen mittels Western Blot Detektion des mittleren Oberflächenproteins 41 (M-Protein) von WHV, GSHV und ASHV Detektion des großen Oberflächenproteins 42 (L-Protein) von WHV, GSHV und ASHV präs 1 -Sequenzierung von ASHV und GSHV Verwendung transgener Pflanzen zur Produktion von 44 Impfstoffen gegen das Hepatitis B Virus Präparation und Aufreinigung der Vektor-DNA Der Vektor ppcv Restriktionsverdau des Vektors Elektrophorese mit Low Melting Point (LMP)-Agarose Verdau der LMP-Agarose mit ß-Agarase Aufreinigung der DNA mit Hilfe von Mikrokonzentratoren Dephosphorylierung des Vektors mit Antarktischer 47 Phosphatase (AP) Präparation und Aufreinigung der Insert-DNA PCR zur Amplifikation der DNA-Fragmente Restriktionsverdau der PCR-Amplifikate Aufreinigung der Insert-DNA Klonierung der WHV-Oberflächenprotein-Plasmide Ligation der Insert-DNA (Expressionskassetten für 50 SWHs, MWHs und LWHs) in den Vektor ppcv Transformation der WHV-Oberflächenprotein-Plasmide in 50 kompetente E. coli Isolierung von Plasmid-DNA aus kompetenten E. coli Selektion und Vermehrung der Plasmid-haltigen E. coli 51 auf Agarplatten und in Flüssigkulturen Minipräparation mittels Alkalischer Lyse Maxipräparation mittels Alkalischer Lyse Photometrische Bestimmung der Konzentration und des 53 Reinheitsgrades der DNA HI

5 3.2.5 Isolierung von mrna aus Pflanzengewebe Nachweis spezifischer mrna mittels RT-PCR (Reverse 54 Transkriptase-PCR) Isolierung subviraler Partikel (HBsAg und WHsAg) aus 55 transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzell-Suspensionskulturen Extraktion der subviralen Partikel (HBsAg und WHsAg) Isolierung und Aufreinigung von subviralen Partikeln 56 (HBsAg und WHsAg) mittels Dichtegradientenzentrifugation Nachweis von HBsAg- sowie WHsAg-Untereinheiten mit- 57 tels SDS-Page und Western Blot Nachweis von HBsAg- sowie WHsAg- Partikeln mittels 57 nativer Agarosegel-Elektrophorese und Western Blot Quantitativer Nachweis von HBsAg mittels den- 58 sitometrischer Auswertung des Chemilumineszenzsignals Nachweis von HBsAg mittels ELISA 58 4 Ergebnisse Experimentelle Infektion von adulten Amerikanischen 60 Waldmurmeltieren mit Woodchuck-, Ground Squirrelund Arctic Squirrel Hepatitis Virus (WHV, GSHV, ASHV) Quantitative Bestimmung der Virus-DNA mittels real-time 61 PCR Schmelzkurvenanalytik Quantitative Bestimmung des Oberflächenantigens mit 64 Hilfe der Laurell-Elektrophorese Untersuchung des Verlaufs der Antigenämie in chronisch 67 WHV-infizierten Woodchucks nach Applikation von DNAund Immunkomplex-Vakzinen in Kombination mit Lamivudin Verlauf des WHsAg unter Lamivudin-Therapie Verlauf des WHsAg unter Lamivudin-Therapie in Kombi- 69 nation mit DNA-Vakzinierung IV

6 Verlauf des WHsAg unter Lamivudin-Therapie in Kombi- 70 nation mit Immunkomplex- und DNA-Vakzinierung Detektion von Oberflächenantigen-Immunkomplexen Nachweis von Immunkomplexen in akut mit WHV infizier- 72 ten Woodchucks Nachweis von Immunkomplexen in chronisch mit WHV 74 infizierten Woodchucks Infektion von Woodchucks mit Woodchuck Hepatitis Virus 75 (WHV) Kinetik der WHV-DNA Kinetik des (freien) WHsAg Detektion von WHsAg-lmmunkomplexen Kinetik von anti-whc und anti-whs Kinetik des Leberenzyms SDH (Sorbitol-Dehydrogenase) Infektion von Woodchucks mit Ground Squirrel Hepati- 82 tis Virus (GSHV) Kinetik der GSHV-DNA Kinetik des (freien) GSHsAg Detektion von GSHsAg-lmmunkomplexen Kinetik von anti-gshc und anti-gshs Kinetik des Leberenzyms SDH (Sorbitol-Dehydrogenase) Infektion von Woodchucks mit Arctic Squirrel Hepati- 85 tis Virus (ASHV) Kinetik der ASHV-DNA Kinetik des (freien) ASHsAg Detektion von ASHsAg-lmmunkomplexen Kinetik von anti-ashc und anti-ashs Kinetik des Leberenzyms SDH (Sorbitol-Dehydrogenase) Vergleichende Analyse der Aminosäuresequenz der 88 ASHV- und GSHV-präS1-Domäne von Inokulum und Virusreplikaten (Nachkommen-Viren) im Serum Isolierung subviraler Partikel von WHV, GSHV und ASHV 89 aus positiven Woodchuckseren

7 Charakterisierung der gereinigten Oberflächenproteine 92 von WHV, GSHV und ASHV SDS-Gelelektrophorese mit anschließender Silberfär- 92 bung Charakterisierung des mittleren Oberflächenproteins (M- 94 Protein) Charakterisierung des großen Oberflächenproteins (L- 95 Protein) 4.2 Verwendung transgener Pflanzen zur Produktion von 97 Impfstoffen gegen das Hepatitis B Virus Nachweis der Expression von HBsAg (SHBs) in Karot- 97 tenzell-suspensionskulturen Extraktion und Aufreinigung von HBsAg aus Karottenzell- 98 Suspensionskultur mittels Dichtegradientenzentrifugation Nachweis von HBsAg (SHBs) im Western Blot nach de- 99 naturierender SDS-PAGE Nachweis von HBsAg-Partikeln im Western Blot nach 101 nativer Agarosegel-Elektrophorese Detektion des HBsAg mittels ELISA Nachweis der Expression von WHsAg-Partikeln in Ta- 103 bakpflanzen Klonierung der für die Oberflächenproteine SWHs-, 104 MWHs- und LWHs-codierenden Gene des Woodchuck Hepatitis Virus (WHV) in den Vektor ppcv Transformation der Oberflächenprotein-exprimierenden 105 Plasmide in Karotten- und Tabakzellen Nachweis von MWHs-mRNA in Zellen transgener Tabak- 106 pflanzen mittels RT-PCR Extraktion und Aufreinigung von WHsAg aus Tabakpflan- 107 zen mittels Dichtegradientenzentrifugation Nachweis von WHsAg (MWHs) im Western Blot nach 107 denaturierender SDS-PAGE Nachweis von WHsAg-Partikeln im Western Blot nach 109 nativer Agarosegel-Elektrophorese VI

8 5 Diskussion Experimentelle Infektion von adulten Amerikanischen 111 Waldmurmeltieren (Woodchucks) mit WHV 5.2 Experimentelle Infektion von adulten Woodchucks mit 115 GSHV und ASHV 5.3 Die Bedeutung der WHV-Infektion von Woodchucks als 119 Modell für die HBV-Infektion des Menschen 5.4 Isolierung von subviralen Partikeln von WHV, GSHV und 121 ASHV aus positiven Woodchuckseren und Charakterisierung der Struktur der Oberflächenproteine von GSHV und ASHV 5.5 Evaluierung der Effizienz von DNA-und Immunkomplex- 124 Vakzinen in Kombination mit Lamivudin gegen die chronische Hepatitis B anhand des Woodchuck-Tiermodells 5.6 Expression von HBsAg- und WHsAg-Partikeln in trans- 127 genen Pflanzen 6 Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Abkürzungen Anhang 154 VII