Genetisch modifizierte dendritische Zellen fiir die Immunisierung. Einfluss einer Hitzeschockprotein-Bindedomane in einem Hamagglutininspezifischen
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1 Genetisch modifizierte dendritische Zellen fiir die Immunisierung Einfluss einer Hitzeschockprotein-Bindedomane in einem Hamagglutininspezifischen Mausmodell Von der Fakultat fur Lebenswissenschaften der Technischen Univefsitat Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von aus Wilhelm Heinrich Meyring Meppen
2 . II Inhaltsverzeichnis Vorveroffentlichungen der Dissertation Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis I II IX XIII 1 Einleitung Dendritische Zellen Systematik der dendritischen Zellen Reifung dendritischer Zellen Antigenaufnahme und -presentation durch dendritische Zellen In vitro Generierung dendritischer Zellen Stimulation von T-Zellen durch DC Immunregulation durch T-Zellen Mogliche Anwendungen gentechnisch modifizierter DC bei der Genimmuntherapie von Krebserkrankungen Genetische Modifikation dendritischer Zellen durch adenovirale Vektoren Vektoren fur den Gentransfer Eigenschaften von Adenoviren Vorteile adenoviraler Vektoren in der Gentherapie Herstellung adenoviraler Vektoren Anwendung genetisch modifizierter DC immausmodell Modellantigen Hamagglutinin Optimierung der Antigenprasentation durch die Hitzeschockprotein- Bindedomane ct T-Zell Rezeptor-(TCR-)transgene Mausmodelle HA als Selbstantigen im Diabetesmodell - InsHA Mause 25 2 Zielsetzung 27 3 Material und Methoden Materialien Gerate Software Verbrauchsmaterialien 30
3 III Oligonukleotide Antikorper Medien, Puffer und Losungen Puffer und Losungen Medien fur die Kultur prokaryotischer Zellen Medien fur die Kultur eukaryotischer Zellen Molekularbiologische Methoden Verwendete.co/j-Stamme Plasmide DNA-Minipraparation DNA-Maxipraparation DNA-Restriktionsspaltung Glyzerolkulturen Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegel Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten Phenol/Chloroform Extraktion und alkoholische DNA-Fallung DNA-Ligation Transformation Chemisch kompetente E.coli-Zellen Elektrokompetente E.coli-Zellen Cosmid-Verpackung in Lambda-Bakteriophagenpartikel Polymerasekettenreaktion TOPO TA Cloning PCR Klonierungssystem DNA-Sequenzierung Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration Kultur eukaryotischer Zellen Verwendete Zelllinien Kultur der Zelllinien Zellzahlbestimmung Kryokonservierung und Auftauen von Zellen Transfektion (Kalziumphosphat-Koprazipitation) Infektion von Zelllinien Isolierung muriner Stammzellen aus Knochenmark 47
4 IV Generierung und Infektion muriner dendritischer Zellen Ernte muriner dendritischer Zellen Rasterelektronenmikroskopie Einzelzellsuspension von Milzzellen Zellsortierung (MACS) Herstellung replikationsdefizienter adenoviraler Vektoren (AdV) Bereitgestellter replikationsdefizienter AdV Herstellung primarer Adenovirusstocks Herstellung sekundarer Adenovirusstocks Herstellung grober Mengen adenoviraler Vektoren CsCl-Aufreinigung von adenoviralen Vektoren Titerung der adenoviraler Vektoren Preparation adenoviraler DNA Nachweis der Transgenexpression Blockade des proteasomalen Abbaus Herstellung von Zelllysaten und Nachweis von Proteinen Denaturierte Zelllysate Native Zelllysate Ko-Immunprazipitation SDS-Gelelektrophorese Westernblot Fluoreszenzmikroskopie Durchflusszytometrie Immunologische Farbung von Oberflachenantigenen Immunologische Farbung intrazellularer Antigene Markierung von Proteinen oder Antikorpern Untersuchung der Immunantwort IFNy-Elispot BrdU-Proliferationsassay Serumgewinnung Immunisierung mit dendritischen Zellen Immunisierung mit Plasmid-DNA Messung des Blutzuckergehaltes CFSE-Markierung 65
5 3.7.8 Adoptiver Transfer spezifischer T-Zellen und DC Zytokinanalyse in Kulturiiberstanden Zellspezifische Messung der IFNy- und IL-2-Produktion Histologie 69 Ergebnisse Herstellung und Charakterisierung rekombinanter adenoviraler Vektoren Herstellung der Hamagglutinin-Varianten Konstruktion der Expressionsplasmide Sequenzierung der Expressionsplasmide Konstruktion der Adenocosmide und adenoviralen Vektoren Charakterisierung der viralen DNA Antigenexpression Nachweis der Expression der adenoviral kodierten Gene Hsp-Bindung durch ct Zellspezifischer Nachweis der Antigenexpression Generierung und Modifikation dendritischer Zellen Einfluss der IL-4 Zugabe auf Reifung und Infizierbarkeit der dendritischen Zellen Optimierung des adenoviralen Gentransfers Charakterisierung der mit unterschiedlichen Vektoren modifizierten dendritischer Zellen Morphologie Einfluss der verschiedenen Vektoren auf die DC-Ausbeute Einfluss der verschiedenen Vektoren auf die Ausreifung der DC Einfluss der verschiedenen adenoviralen Vektoren auf die Zytokinsekretion Analyse der Hamagglutinin-spezifischen Immunantwort in vitro Stimulation HA-spezifischer TCR-transgener CD4 + T-Zellen IFNy-Sekretion stimulierter T-Zellen Proliferation DC-stimulierter CD4 + T-Zellen Zytokinsekretion DC-stimulierter CD4 + T-Zellen Stimulation HA-spezifischer TCR-transgener CD8 + T-Zellen IFNy-Sekretion stimulierter CD8 + T-Zellen Proliferation DC-stimulierter CD8 + T-Zellen 113
6 VJ Zytokinsekretion DC-stimulierter CD8 + T-Zellen Analyse der Hamagglutinin-spezifischen Immunantwort in vivo Immunisierung durch modifizierte DC oder Plasmid-DNA Einfluss der Vakzinierungsmethode auf die Zellzahl/Milz Einfluss der Vakzinierungsmethode auf regulatorische T-Zellen der Milz Diabetes in InsHA Mausen Aktivierung HA-spezifischer Milzzellen Immunantwort gegen FCS-Bestandteile Immunisierung durch modifizierte DC nach dem adoptivem Transfer spezifischer T-Zellen Einfluss der Vakzinierung auf die Zellzahl/Milz Analyse der Immunantwort in BALB/c Mausen nach adoptiven T-Zell Transfer Analyse der Immunantwort in InsHA Mausen nach adoptivem T-Zell Transfer Diskussion Antigenexpression in humanen Zelllinien Expression des ct Expression des HA und des ctha Expression der verkiirzten HA-Varianten TCRCL4, cttcrcl4 und TCR, cttcr Faktoren die die Stabilitat der Antigene beeinflussen konnten Optimierung der Generierung und Modifikation dendritischer Zellen Protokolle fur die in vitro Generierung muriner DC Optimiertes Protokoll fur die in vitro Generierung adenoviral modifizierter DC Kultivierungsdauer Verwendung der Zytokine GM-CSF und IL Infektion dendritischer Zellen durch adenovirale Vektoren Expression der Transgene in murinen dendritischen Zellen Ausreifung der DC durch LPS Reinheit und Ausreifung adenoviral modifizierter DC Stimulation spezifischer T-Zellen durch adenoviral modifizierte DC in vitro Stimulation spezifischer CD8-positiver T-Zellen 166
7 VII Stimulation spezifischer CD4-positiver T-Zellen Modell der Antigenprozessierung und -presentation Immunisierung HA-reaktiver und -toleranter Mause Aktivierung HA-reaktiver zytotoxischer T-Zellen in BALB/c Mausen Aktivierung HA reaktiver zytotoxischer T-Zellen in InsHA Mausen Periphere Toleranz in InsHA Mausen Zentrale Toleranz in InsHA Mausen Aktivierung CD4 + T-Helferzellen HA-unabhangige Aktivierung der Milzzellen durch in vitro generiertedc FCS-spezifische Aktivierung der Milzzellen durch in vitro generiertedc Immunisierung nach adoptivem Transfer Immunantwort DC-immunisierter BALB/c Mause nach dem adoptiven transfer HA-spezifischer T-Zellen Immunantwort DC-immunisierter InsHA-Mause nach dem adoptiven transfer HA-spezifischer T-Zellen Aktivierung adoptiv transferierter HA-spezifischer T-Zellen Pankreas-Histologie und Diabetes Durchbrechung der HA-spezifischen Toleranz im InsHA Modell Ausblick Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang Abkiirzungsverzeichnis Phanotypische Oberflachenmarker zur Charakterisierung verschiedener Zelltypen Symbole fur Aminosauren 220 Danksagung 221
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