Rekombinante DNA-Technologien

Transkript

1 9 0 Rekominnte DN-Tehnologien 0.1 Expression rekominnter roteine Expression eines Fusionsproteins in E. oli. Ds Expressionsplsmid enthält neen einem Resistenzgen (mp r ) und dem Repliktionsstrt (oric) den l-romotor. Hinter diesem ist die kodierende Region eines kteriellen roteins, hier Glutthion--Trnsferse (GT), kloniert (run). Im nshluss drn knn der proteinkodierende Teil eines eukryotishen Gens, hier ein shnitt des Drosophil-Gens rums, kloniert werden (grün). Durh Trnsfektion werden die lsmide in Bkterienzellen gerht. Nh Zuge von ITG ins Medium werden die Gene trnskriiert und die roteine in großer Menge trnsltiert. Links: nur die kterielle Glutthion--Trnsferse, rehts: Fusionsprotein us GT und Crums-shnitt. d uftrennung von roteinextrkten us niht-induzierten (-) und mit ITG induzierten (+) Bkterien. Die roteine sind durh die so gennnte Coomssie-Färung sihtr gemht, * = induzierte roteine, pur 1, = lsmid mit kodierender Region der Glutthion--Trnsferse (. 0 kd), pur, = lsmid mit Fusionsprotein (Glutthion-- Trnsferse plus eukryotishes rotein,. 5 kd), M = Mrker. mp r RN ori + ITG induziertes rotein: GT 5kD 0kD l-romotor kterielles Gen GT Eo RI * M 1 + ltion eines eukryotishen roteins in einer prokryotishen Zelle zu umgehen und um eine möglihst effektive Trnsltion eukryotisher roteine in Bkterienzellen zu ermöglihen, wird häufig ds eukryotishe Gen hinter den proteinkodierenden shnitt eines kteriellen Gens kloniert, wodurh ein prokryotishes Inititionsodon ereit gestellt wird (. 0.1). nshließend wird ds lsmid durh Trnsformtion in die Bkterienzelle, meist E. oli, gerht (. 0.1). Nh Vermehrung der Zellen und Zuge des Induktors ITG wird ds Gen trnskriiert und, wie ei rokryonten ülih, gleihzeitig trnsltiert (. 0.1). Ds exprimierte eukryotishe rotein enthält in seinem N-terminlen shnitt Bereihe des kteriellen roteins, z. B. solhe mp r induziertes Fusionsprotein: GT + eukryotishes rotein + ITG * RN ori Bkteriengenom l-romotor kterielles Gen GT Eo RI eukryotishes Gen Eo RI Expressionsplsmid Bkteriengenom Expressionsplsmid + ITG ntigenindende telle H N H N leihte Kette der -Glktosidse oder der Glutthion--Trnsferse, es entsteht ein sog. Fusionsprotein (. 0.1). D die lsmide meist in hoher Kopienzhl in der Zelle vorliegen und ein strker romotor die Trnskription sehr oft pro Minute initiiert, knn ds rekominnte rotein in großer Menge synthetisiert werden (es knn mnhml is zu 10% der Msse ller roteine einer Bkterienzelle usmhen) (. 0.1d). Ds rotein knn nh ufshluss der Bkterienzelle ngereihert und gereinigt werden und der kterielle nteil knn, wenn erforderlih, enzymtish gesplten werden. Die ersten uf diese Weise hergestellten menshlihen roteine wren omtosttin, ein Whstumshormon (1977) und Insulin (1979). Ursprünglih wurde ds für die Behndlung zukerkrnker tienten nötige Insulin us der Buhspeiheldrüse von hweinen und Rindern isoliert. D dieses zwr eine ähnlihe, jedoh niht identishe minosäuresequenz wie ds menshlihe rotein esitzt, zeigten einige tienten, denen es injiziert worden wr, eine strke Immunrektion. D ds in Bkterien hergestellte Insulin die minosäuresequenz des menshlihen Hormons esitzt, leit seine immunogene Wirkung us. Heute werden viele Enzyme und ndere medizinish relevnte roteine in großem Mßst iotehnologish hergestellt, z. B. Gerinnungsfktoren zur Therpie von Hämophilie (Bluterkrnkheit) und zhlreihe Impfstoffe ntikörper gegen Fusionsproteine HOOC shwere Kette HOOC Für viele Frgestellungen in der Molekulriologie, Biohemie, Entwiklungsiologie oder Humnmedizin werden ntikörper eingesetzt. ntikörper sind roteine, die strk und meist sehr spezifish n ein Zielprotein, ds ntigen, inden und von Verterten zur wehr von Infektionen produziert werden. Jedes ntikörpermolekül ist us zwei identishen shweren Ketten (us jeweils etw 0 minosäuren estehend) und zwei identishen leihten Ketten (us jeweils etw 0 minosäuren) ufgeut, die eine hrkteristishe truktur usilden (. 0.). COOH COOH shwere Kette NH ntigenindende telle NH leihte Kette ntigen mrkierter sekundärer ntikörper primärer ntikörper. 0. truktur eines ntikörpermoleküls. Die zwei leihten und die zwei shweren Ketten sind üer Disulfidrüken () verunden. Die N- terminlen Regionen der vier Ketten ilden zwei ntigenindungsstellen us, die für jedes ntikörpermolekül spezifish sind. Ein n ein ntigen (rot) geundener ntikörper (grün) knn mit Hilfe eines sekundären ntikörpers (lu) sihtr gemht werden. Der sekundäre ntikörper erkennt die konservierten shnitte des primären ntikörpermoleküls. m C- Terminus des sekundären ntikörpers knn ein Enzym oder ein Fluoreszenzfrstoff, ein Fluorohrom, gekoppelt sein (gel). D mehrere sekundäre ntikörper gleihzeitig n einen primären ntikörper inden können, erhält mn ddurh eine Verstärkung des ignls.

2 96 0 Rekominnte DN-Tehnologien 0.1 Expression rekominnter roteine 97 Die N-terminlen Regionen von jeweils einer shweren und einer leihten Kette ilden die Bindungsstelle für ds jeweilige ntigen, so dss jedes ntikörpermolekül zwei Bindungsstellen ufweist. ntikörpermoleküle, die untershiedlihe ntigene erkennen, untersheiden sih in der ntigenindungsregion. D ein Tier Tusende von vershiedenen ntikörpern herstellen knn, edeutet dies, dss es eine sehr große Vriilität der ntigenindungsregionen git. Die C-terminlen Regionen vershiedener ntikörpermoleküle sind hingegen sehr konstnt. Um spezifishe ntikörper gegen ein Fusionsprotein herzustellen, wird zunähst die Expression des kteriellen Fusionsproteins induziert (s.. 0.1) und dieses us den Bkterien isoliert. Ds Fusionsprotein wird nun in Mäuse, Rtten, Kninhen oder Meershweinhen injiziert. Die Tiere regieren druf mit der ynthese von ntikörpern. Nh wiederholten Injektionen im stnd von mehreren Wohen enthält ds erum des Tiers ntikörper, die spezifish gegen ds Fusionsprotein gerihtet sind. Dieses erum knn nun in vershiedenen Experimenten eingesetzt werden, z. B. in einem Western-Blot (s. Kp ,. 19.1). Hierei üerträgt mn roteine, die vorher durh Gelelektrophorese entsprehend ihrer Größe ufgetrennt wurden, uf eine Memrn. Die Memrn wird mit dem ntikörper inkuiert, und der ntikörper indet spezifish n ds rotein, gegen den er gerihtet ist. Es wird ein zweiter ntikörper hinzugefügt, der spezifish equenzen in den konstnten shnitten des ersten ntikörpers erkennt und der ußerdem mit einem Enzym, z. B. lklisher hosphtse oder mit einem Fluorohrom, gekoppelt ist (s.. 0.). Nh der Bindung des zweiten ntikörpers n den ersten ntikörper uf der Memrn und Zuge des ustrts für ds Enzym wird dieses umgesetzt. Ds Rektionsprodukt knn dnn uf vershiedene Weise nhgewiesen werden. Heute wird häufig ein ustrt verwendet, ds nh Einwirkung durh ds Enzym fluoreszierende trhlung ussendet (Chemilumineszenz). Diese ist, ähnlih wie rdioktive trhlung, in der Lge, die lihtempfindlihe Emulsion uf einem Film zu shwärzen (vgl. Box 19.). uf diese Weise wird die osition des roteins, ds von dem ntikörper erknnt wurde, ls Bnde sihtr (. 0.). Western-Blots dienen u.. zur Bestimmung der roteingröße oder zur Erkennung seiner Expression in vershiedenen Geween oder in vershiedenen Entwiklungsstdien. ntikörper können uh zum Nhweis der Loklistion eines roteins innerhl einer Zelle verwendet werden (. 0.) Expression von roteinen in eukryotishen Zellen Es ist eknnt, dss viele eukryotishe roteine nh der Trnsltion noh verändert werden. Dies etrifft vor llem Memrnproteine und sezernierte, lso us der Zelle usgeshleuste roteine, die vielfältig glykosyliert werden oder roteine, die erst durh Reifung in einen ktiven Zustnd üerführt werden (s. Kp ). D Bkterien niht in der Lge sind, diese Modifizierungen durhzuführen, wird oftmls uf eukryotishe Zellen zur roduktion rekominnter eukryotisher roteine zurükgegriffen. Hierei verwendet mn vorzugsweise Hefezellen, die leiht zu trnsformieren und zu vermehren sind. er uh Zellkulturzellen höherer Eukryonten finden hierfür nwendung. Die verwendeten Expressionsvektoren erfüllen prinzipiell die gleihen nforderungen wie kterielle lsmide: ie hen einen eigenen kd M ITG Isolierung des Fusionsproteins M 1 Injektion des Fusionsproteins Blutentnhme und Kontrolle des erums M Größenmrker 1 Trennung der roteine us Drosophil-Emryonen Üertrgung der roteine us pur 1 uf ein Filter und Inkution mit einem spezifish gegen Crums gerihteten ntikörper Repliktionsstrt und in den meisten Fällen eine multiple Klonierungsstelle. Ferner trgen sie ein Gen, ds die elektion trnsformierter Zellen erlut, z. B. ein Resistenzgen gegen ein ntiiotikum (in vielen Fällen gegen Neomyin, ds die mitohondrile roteinsynthese hemmt, vgl. Kp.15.), und sie esitzen einen induzierren romotor. Entsprehend der Vorgehensweise ei Bkterien wird der kodierende Teil eines Gens, meist eine DN, in ds lsmid kloniert und in die Zellen eingerht, ws uf vershiedene Weise erfolgen knn: entweder durh Trnsfektion (ähnlih wie ei Bkterien, s. Kp ), durh Injektion der DN direkt in die Zelle oder durh Beshuss mit rtikeln, deren Oerflähe mit der lsmid-dn eshihtet ist (prtile omrdment). In Gegenwrt des ntiiotikums können nur die Zellen, die ein lsmid erhlten hen, üerleen und sih vermehren. Nh Zuge des Induktors erfolgt die Trnskription des klonierten Gens und Trnsltion des roteins, ds nshließend us den Zellen isoliert werden knn. Eukryotishe Expressionsvektoren werden niht nur zur nreiherung und nshließenden Isolierung eines roteins verwendet, sondern dienen oftmls uh zur funktionellen nlyse eines roteins. Eine wihtige nwendungsmethode ist ds sog. Hefe-Zwei-Hyridsystem. E * V ED. 0. Herstellung von ntikörpern. Ein Fusionsprotein estehend us GT und einem Teil des Drosophil-Crums-roteins (s.. 0.1) wird in eine Rtte injiziert. Nh mehreren Injektionen enthält ds erum der Rtte neen vielen nderen ntikörpern uh ntikörper gegen ds Fusionsprotein. Ds ntiserum knn nun zum Nhweis eines roteins in einem roteingemish verwendet werden. Hier wurden die Gesmtproteine us Drosophil-Emryonen entsprehend ihrer Größe elektrophoretish ufgetrennt, die roteine werden uf eine Memrn üertrgen (Western-Blot) und diese mit dem ntikörper inkuiert. Nh Verstärkung mit einem sekundären ntikörper (s.. 0.) knn die osition des Crums-roteins sihtr gemht werden. Ein gegen Crums gerihteter ntikörper erlut die Loklistion des roteins im Drosophil- Emryo. Ds rotein ist in Epithelien exprimiert und dort nur in der piklen Memrn (feilkopf), niht in der lterlen und slen (tern) Memrn. V = Vorderdrm ED = Enddrm E = Epidermis.

3 98 0 Rekominnte DN-Tehnologien 0. Trnsgene Orgnismen 99 Dieses wird u.. zum Nhweis einer direkten Bindung zwishen zwei roteinen eingesetzt. Mn mht sih hierei die Ttshe zunutze, dss ein Trnskriptionsfktor zwei funktionelle Bereihe esitzt, eine DN-Bindungsdomäne und eine trnsktivierende Domäne (s. Kp ). Erstere erkennt und indet eine spezifishe DN-equenz, während letztere mit Komponenten der Trnskriptionsmshinerie intergiert und somit die Trnskription ktiviert. Im Hefe-Zwei-Hyridsystem werden zwei Expressionsplsmide gleihzeitig in eine Hefezelle trnsformiert, woei die eiden lsmide jeweils vershiedene Fusionsproteine kodieren: Ds eine Fusionsprotein esteht us der DN-indenden Domäne eines Hefe-Trnskriptionsfktors, z. B. GL-BD, fusioniert mit dem zu testenden rotein, gennnt Köderprotein. Ds ndere lsmid kodiert ein Fusionsprotein us der trnsktivierenden Domäne, GL-D, fusioniert n ds rotein B, ds Beuteprotein (. 0.). Nh Trnsformtion mit eiden lsmiden werden die Fusionsproteine geildet. Können die roteine und B neinnder inden, so werden die DN-indende- und die trnsktivierende Domäne von GL in enge Nhrshft gerht, ein funktionsfähiger Trnskriptionsfktor ist wieder hergestellt. Die Hefezellen enthlten ußerdem ein sog. Reportergen, ds die Bindungsstellen für GL, die upstrem tivting sequenes (U) enthält. Ds Reportergen wird nur dnn trnskriiert, wenn ein funktionelles GL-rotein, estehend us eiden Domänen, geildet wird und n die U indet. Ds Genprodukt des Reportergens, im hier gezeigten Beispiel ds Gen für die kterielle -Glktosidse, ist leiht nhzuweisen. Nh Zuge des ustrts X-Gl wird dieses durh -Glktosidse zu einem luen Rektionsprodukt umgesetzt: Die Hefekolonien fären sih lu (. 0.) Ds Hefe-Zwei-Hyridsystem wird uh dnn verwendet, wenn mn Bindungsprtner eines eknnten roteins finden will. In diesem Fll wird ds eknnte rotein ls Fusionsprotein mit der DN-Bindungsdomäne von dem sog. Köderplsmid kodiert. D mn den Bindungsprtner noh niht kennt, müssen möglihst viele roteine getestet werden. Wie erhält mn nun diese uneknnten roteine? Hierzu stellt mn eine DN-Bnk her (s. Kp ), woei der verwendete Vektor ds Beuteplsmid ist (s.. 0.). Jede DN, die in diesen Vektor im rihtigen Leserster kloniert ist, knn nun ls Fusionsprotein mit der DN-ktivierungsdomäne exprimiert werden. Nun wird diese DN-Bnk in solhe Hefezellen trnsformiert, die ds Köderplsmid und ein Reportergen enthlten, d. h. jede Hefezelle trägt dnn neen dem Köder- uh ein Beuteplsmid, woei untershiedlihe Hefezellen Beuteplsmide mit untershiedlihen proteinkodierenden Regionen enthlten und somit untershiedlihe Fusionsproteine kodieren. Nur wenn ds Beuteplsmid ein rotein kodiert, ds mit dem eknnten, vom Köderplsmid kodierten rotein intergiert, kommt es zur Bildung eines vollständigen Trnskriptionsfktors, der nh Bindung n die regultorishe equenz des Reportergens dessen Expression induziert. Ds Beuteplsmid knn nun us den Hefezellen isoliert und die equenz der DN estimmt werden. Durh weitere reiten muss dnn llerdings estätigt werden, dss die vom Köder- und Beuteplsmid kodierten roteine uh ttsählih in vivo miteinnder intergieren. mp r 0. Trnsgene Orgnismen Ködervektor Beu D Kö BD U G GL1-romotor leu + Gl-BD Köderprotein lz-rn lz-gen Gl-D Beuteprotein B trp1 + mp r In Kp. 19 wurde gezeigt, dss die Herstellung rekominnter DN die Vermehrung und Chrkterisierung einzelner Gene, Genshnitte oder DNs ermögliht. Die Vermehrung der klonierten DN erfolgt meistens in Bkterien, die somit trnsgene Orgnismen oder gentehnish veränderte Orgnismen (GvO) drstellen, d sie zusätzlih zu ihrem eigenen Genom Fremd-DN trgen. Heute ist es möglih, Trnsgene uh in höhere Orgnismen, etw Drosophil, Mus oder flnzen, einzuringen und somit vielzellige trnsgene Orgnismen herzustellen. nders ls Bkterien esitzen die meisten vielzelligen Orgnismen keine extrhromosomlen lsmide, üer die mn ein Trnsgen in die Zelle einshleusen könnte. Ds edeutet, dss die zusätzlihe DN in ds Genom integriert werden muss, wenn sie stil n die Nhkommen verert werden soll. Noh ein weiteres rolem ergit sih ei der Erzeugung trnsgener vielzelliger Orgnismen. Bringt mn ein Trnsgen in eine Bkterienzelle ein, so werden lle ihre Nhkommen dieses Trnsgen eren. Bringt mn ein Trnsgen in eine Körperzelle eines vielzelligen Orgnismus, Kotrnsformtion in leu -trp -Hefezellen Replikplttierung uf Medium mit X-Gl -Glktosidse Beutevektor elektion von leu + -trp + -Hefezellen Trnsltion + X-gl Trnskriptionskomplex Blufärung. 0. Ds Hefe-Zwei-Hyridsystem zur Untersuhung von rotein-rotein-interktionen. Der Ködervektor kodiert ein Fusionsprotein, estehend us der DN-Bindungsdomäne des Trnskriptionsfktors Gl (Gl-BD, gel) und dem rotein, dessen Interktion getestet werden soll (Köderprotein ; gru). leu kodiert für -Isopropylmlt-Dehydrogense, ein Enzym der Leuiniosynthese. Der Beutevektor kodiert ein Fusionsprotein estehend us der ktivierungsdomäne von Gl (Gl-D, olivgrün) und dem zweiten Interktionsprtner, dem Beuteprotein B (run). Es trägt zusätzlih trp1, ds die für die Tryptophniosynthese nötige N-(5 -hosphoriosyl)-nthrnilt-isomerse kodiert. Beide lsmide werden gleihzeitig in Hefezellen trnsformiert und die Zellen werden dnn uf grpltten ohne Leuin und Tryptophn usplttiert. Nur die Zellen, die eide lsmide erhlten hen, können unter diesen elektionsedingungen whsen. Durh die Interktion von Beute- und Köderprotein wird ein funktionsfähiger GL-Trnskriptionsfktor hergestellt, der nun n den GL1-romotor (U G ; upstrem tivting sequene) inden knn, ws zur Trnskription des Reportergens lz führt. Die nh Trnsltion geildete -Glktosidse knn ds zugegeene ustrt X-Gl umsetzen, ws zu einer Blufärung führt. Filter mit Hefekolonien, in denen eine Interktion zwishen Köder und Beute stttgefunden ht (1 und ) zw. niht stttgefunden ht (ürige Kolonien) [ Bild von Özlem Kilin, Düsseldorf].

4 58 Die Genetik der lrvlen egmentierung ei Drosophil. Die sequenzielle Unterteilung des Emryos Regultoren des even-skipped- treifens : Hunhk, Gint und Krüppel. Färung von Wildtyp-Emryonen mit fluoreszenzmrkierten ntikörpern gegen Eve (rot) und H Gt Kr (jeweils grün). Üerlppungsereihe ersheinen jeweils gel. Die eteiligten roteine sind Trnskriptionsfktoren, dher sind die Zellkerne ngefärt [Bilder von Dvid Kosmn und John Reinitz, New York, s. Kosmn et l. 1998]. Bioid und Hunhk eteiligt sowie die Gp-Gene gint und Krüppel. Durh die pssenden Morphogenkonzentrtionen von Bd und H wird die Expression des treifens ktiviert. Die Eingrenzung der eve-ktivität üernimmt gint n der nterioren, Krüppel n der posterioren Grenze; eve wird genu dort exprimiert, wo gint und Krüppel ihre geringste ktivität zeigen (..18, ). In der Kontrollregion von eve (..18 ) sind Elemente eknnt, die für die rihtige usildung der treifen, und 7 notwendig sind. Die Regionen für die ürigen treifen sind noh niht genu definiert. In der DN des treifen--elements wurden equenzereihe gefunden, n denen die roteine der ktivtoren Bd und H sowie der Repressoren Gt und Kr inden können. Die Regultion des eve-treifens knn durh die Expressionsmuster der eteiligten Gene vernshuliht werden (..19). Färt mn Wildtyp-Emryonen mit fluoreszenzmrkierten ntikörpern gegen Eve, so wird ds treifenmuster sihtr. Färt mn gleihzeitig mit ntikörpern gegen H, so ist die Region der ersten eiden eve-treifen eingeshlossen (..19 ). Die Färung mit ntikörpern gegen Gt reiht genu is zur nterioren Grenze (..19 ), die gegen Kr is zur posterioren Grenze des. eve-treifens (..19 ). Bei der Initiierung des treifenmusters eines rregelgens spielen ndere rregelgene nur eine untergeordnete Rolle. ie sind jedoh notwendig für die ufrehterhltung des exkten Musters. Eine Möglihkeit, diese gegenseitige Beeinflussung zu studieren, ist die nlyse des Expressionsmusters eines rregelgens im mutnten Genotyp eines nderen. In..0 ist dies m Beispiel der drei primären und eines sekundären rregelgens, nämlih fushi-trzu (ftz) drgestellt. Im Wildtyp (..0 ) esteht ds Muster jeweils us 7 Querstreifen, woei die Muster von eve und ftz den Grenzen der rsegmente folgen und komplementär zueinnder sind (..1). Die treifen von hiry und runt queren die rsegmentgrenzen und sind eenflls komplementär usgeprägt. In den vier mutnten Emryonen sind die treifen der drei nderen Gene zwr lle vorhnden, die Intensität, Lge und Breite der treifen knn er vriieren. In hiry -Emryonen (..0 ) sind die eve-treifen, 5, 6 und 7 nur sehr shwh usgeprägt, die runt-expression tritt vermindert uh zwishen den eigentlihen treifen uf und die ftz-treifen sind reiter ls norml. In eve - Emryonen (..0 ) exprimieren im hiry-, runt- und ftz-muster einige treifen shwäher und ei runt rüken die treifen 1 und sowie und näher zusmmen. ¾hnlihes gilt für die hiry-treifen in runt - Emryonen (..0d), in denen uh die Intensität des eve-treifens 5 und einiger ftz-treifen vermindert ist. Der ftz -Genotyp ht keinerlei Einfluss uf die Expressionsmuster der drei nderen Gene (..0e). Ds Beispiel zeigt, dss sih die drei primären rregelgene untereinnder eeinflussen und uh die Expression sekundärer rregelgene, wie ftz, verändern können. Im ftz-genotyp wird dgegen ds Muster der primären rregelgene niht modifiziert. Ds ftz-treifenmuster wird genetish uh etws nders festgelegt. Es git zwr uh eine folge der Initiierung der 7 treifen ereits im synzytilen Blstoderm, ds Gesmtmuster wird er zunähst von Elementen der ftz-kontrollregion, insesondere des Zer-Elements gesteuert (s...). Molekulre Detils zur Regultion der rregelgene untereinnder sind isher nur in geringem Umfng eknnt. rsegment hiry + d e hiry hiry + eve hiry + runt hiry + ftz egmentpolritätsgene stilisieren Komprtimentsgrenzen Ds Muster der 1 rsegmente entsteht im synzytilen Blstodermstdium durh die Genkskde der mternlen, Gp- und rregelgene. Nh der Zellulrisierung nehmen ihre ktivitäten und vershwinden innerhl der nähsten eiden tunden der Entwiklung, zum Ende der Gstrultion. Die eteiligten roteine sind DN-indende Trnskriptionsfktoren, wie z. B. n der Expression von ftz und eve in..1 zu erkennen ist: Die Färung mit ntikörpern ist kernspezifish. n dieser ildung fällt weiterhin uf, dss die Färung im rälstodermstdium (..1 ) innerhl der rsegmente niht einheitlih ist, sondern einen nterior-posterioren Grdienten erkennen lässt. Im zellulären Blstoderm hingegen (..1 ) sind die Grenzen shärfer und klrer. Der Grund dfür ist die ktivität der egmentpolritätsgene. ie verdnken ihren Nmen den mutnten hänotypen, die ds Differenzierungsmuster oder die olrität jedes lrvlen egments verändern (s...). Ds Expressionsmuster esteht dher in jedem Fll us 1 treifen, in jedem rsegment einer. In dieser Gruppe git es Gene wie engriled (en) ls Trnskriptionsfktoren und ndere, deren roteine sezerniert werden, wie wingless (wg) oder hedgehog (hh). Ds zunähst wihtigste egmentpolritätsgen ist engriled. eine ktivität wird von rregelgenen wie ftz kontrolliert. Hier trifft ds Beispiel der..1 exkt zu: In engriled-mutnten Emryonen wird ds ftz-muster norml exprimiert, in ftz-mutnten Emryonen fehlen..0 Regultion des treifenmusters durh rregelgene. s. Text [nh Weigmnn et l. 00]...1 Die treifenmuster von eve (lugru) und ftz (run) sind komplementär. ntikörperfärung n Wildtyp-Emryonen im synzytilen () und zellulären () Blstodermstdium. Im ynzytium zeigen die Färungen einen nteriorposterioren Expressionsgrdienten (), etws später (B) sind Färungen klr eingegrenzt [ Blkwell ientifi ulitions 199: Lwrene,..: The mking of fly. Blkwell ientifi ulitions 199].

5 60 Die Genetik der lrvlen egmentierung ei Drosophil.5 Homeotishe Gene ls Kontrollgene 61.. rsegmente und egmente. Die shrittweise tilisierung von rsegment- und egmentgrenzen eginnt mit der prsegmentlen Expression von rregelgenen. Die nteriore rsegmentgrenze wird durh die ktivierung von en definiert und durh die ktivierung von wg uf der nderen eite der Grenze gefestigt. d Nh Zellvermehrung wird die posteriore Grenze der en-ktivität ls egmentgrenze definiert. e Die Expression von Ftz und Eve wird eendet. Ein egment esteht nun us jeweils einem nterioren () und einem posterioren () Komprtiment. d Ftz Eve Ftz Eve en en en en en wg en wg en wg en wg en wg en e Wg En Wg En Wg En Wg En Wg En T T 1 die engriled-treifen in den gerdzhligen rsegmenten, in denen ftz exprimiert wird. Wie die Gp- und rregelgene kontrollieren uh die egmentpolritätsgene ihre ktivitäten gegenseitig. Dies führt shließlih zu einer duerhften tilisierung der rsegment- und egmentgrenzen. rsegmente egmente.. zeigt shemtish einen usshnitt der Oerflähe eines Emryos während der Zellulrisierung mit der Expression von ftz (rot) und eve (lu). Im Blstodermstdium wird in der vordersten Zellreihe jeden rsegments, ds nur etw Zellreihen reit ist, engriled ktiviert (..). Dies ht zur Folge, dss diesem Zeitpunkt die Grenze zwishen zwei rsegmenten fixiert ist. Die duerhfte tilisierung der Grenze geshieht durh ds Zusmmenwirken von engriled mit hedgehog und wingless (..). Hh und Wg sind sezernierte ignlproteine, die in enhrten Zellen Gene ktivieren können. uf der einen eite der Grenze exprimieren die Zellen engriled und werden ddurh zur Expression von hedgehog ngeregt. Hedgehog ktiviert in der enhrten Zelle uf der nderen eite der Grenze ds wingless-gen. Ds Wingless-rotein setzt einen positiven Rükkopplungsmehnismus in Gng: Es sorgt in der enhrten engriled-exprimierenden Zelle für die weitere Expression von en und dmit hh. o knn der Zyklus wieder eginnen. Während eines kurzen Entwiklungsstdiums m Ende der Gstrultion knn mn die Grenzen der rsegmente ls Furhen zwishen den Expressionsdomänen von en und wg erkennen (feile in..). Nh dem Blstodermstdium finden durhshnittlih noh etw Zellteilungen sttt (.. e). Die ktivitäten von ftz und eve werden eendet (.. e). päter kommt es zur usprägung der endgültigen egmente. Dei wird die posteriore Grenze der en-expression zur egmentgrenze. Die en-exprimierenden Zellen stellen lso ds posteriore Komprtiment jedes egments dr, während die dvor liegenden Zellen is zur nähsten egmentgrenze ds nteriore Komprtiment definieren. Hier sind neen wg noh weitere egmentpolritätsgene ktiv, durh die shließlih ds Muster der Kutikulzähnhenänder differenziert wird (s.. 1.). Die nterioren und posterioren Grenzen der engriled-ktivität sind zugleih Komprtimentsgrenzen. Ein entwiklungsgenetishes Komprtiment ist eine Gruppe von Zellen, die genetish determiniert ist, mit seiner gesmten mitotishen Zellnhkommenshft ein estimmtes Entwiklungsshiksl zu durhlufen. Die Zellen innerhl eines Komprtiments vermishen sih während der weiteren Entwiklung niht mehr mit den Zellen eines enhrten Komprtiments, sie erfüllen voneinnder getrennte ufgen. Experimentell wurden die Komprtimentsgrenzen durh die nlyse von Zellklonen gefunden (Box.1). Die engriled-ktivität leit vom Blstoderm üer die Lrvenstdien und die Metmorphose is zum Tod der Fliege in jedem posterioren Komprtiment erhlten. llein seine ktivität definiert ds posteriore Komprtiment und steuert ddurh dort weitere Genktivitäten..5 Homeotishe Gene ls Kontrollgene In llen 1 rsegmenten werden dieselen egmentpolritätsgene ktiviert (s...). Die Lrve und später die Fliege zeigen jedoh ein usgeprägtes segmentspezifishes Differenzierungsmuster. Wie ekommen lso die rsegmente zw. egmente ihre spezifishe genetishe Identität? Im Jhr 1915 fnd Clvin Bridges eine spontne Mutnte, ei der ein Teil des. in ein. Thorxsegment umgewndelt wr: ttt des wg Hh Wg hh en Die enwg-rükkopplung n der rsegmentgrenze. en-expression. Der Vergleih der en-expression mit der wg-expression () in jeweils 1 treifen zeigt die komplementäre Lge n der rsegmentgrenze. hemtishe Drstellung jeweils einer Zelle n der Grenze zwishen den rsegmenten und (shwrze feile zu den usshnittsvergrößerungen) und dem genetishen Rükkopplungsmehnismus (s. Text). wg-expression

6 6 Die Genetik der lrvlen egmentierung ei Drosophil.5 Homeotishe Gene ls Kontrollgene 6.. Klonle nlyse. mwh homozygote Klone in heterozygoter Umgeung von vershiedenen Flügeln in ein hem gezeihnet. Dunkelrote Üerlppungsereihe von Klonen zeigen, dss trukturen des Flügels niht ufgrund ihrer mitotishen Herkunft differenziert werden, sondern entsprehend ihrer ositionsinformtion. Wähst ein solher Klon in einer Minute-Umgeung, so ist er is zur Differenzierung einige Teilungsrunden weiter. Er stößt hier n die genetish definierte Grenze zwishen dem nterioren () und posterioren () Komprtiment des Flügels (rote Linie). usshnitt us einem Flügel mit einem mwh- Klon im nterioren Komprtiment (entsprehend dem Rhmen in ) [, nh Grí-Bellido et l. 1979]. Box..1 Klonle nlyse Wenn mn erfhren möhte, welhen Entwiklungsweg eine einzelne Zelle und ihre mitotishen Nhkommen, lso der Zellklon, hen werden, wird mn diese Zelle so mrkieren, dss mn sie zu einem späteren Zeitpunkt zw. Entwiklungsstdium wieder erkennen knn. Derrtige Experimente sind ei vielen Orgnismenrten durhgeführt worden. Bei Drosophil sind, z. B. die Injektion eines Frstoffs, die Trnsplnttion durh eine Muttion genetish veränderter Zellen unter Wildtyp-Zellen oder die nwendung mitotisher Rekomintion (s in Kp.10.7) ls Mrkierungsmethoden zu nennen. Für die Untersuhung mrkierter Zellklone eignet sih ei der Fliege gnz esonders der Flügel. Die Flügeloerseite wie die -unterseite esteht us einer einzigen Zellshiht, ei der die Kutikul der Zellen ein so gennntes Härhen differenziert. Es git ds utosomle Gen multiple-wing-hirs (mwh), ds ls Mutnte ein kleines Büshel von Härhen ildet. Bestrhlt mn lso Emryonen im Blstodermstdium, die heterozygot mwh/mwh + sind, mit Röntgenstrhlen, so wird mn im Flügel mwh homozygote Klone finden, wie sie in.. shemtish drgestellt sind. Diese Klone sind reltiv klein, owohl dem Blstodermstdium etw 10 Mitosen stttfinden. Um heruszufinden, wie groß ein Klon mximl werden knn, d. h. welhen Bereih er entwiklungsgenetish esetzen knn, wurde die so gennnte Minute-Tehnik eingeführt. Der hänotyp von Mutnten von Minute (M)-Genen ist vor llem lngsmes Whstum, d. h. verlängerter Zellzyklus. Induziert mn einen M + -Klon in einem M-Emryo, so wird der M + -Klon is zur Differenzierung mehr Zellteilungen durhlufen ls seine M-Umgeung. Kominiert mn Minute mit mwh-mrkierung, erhält mn Klone, die entwiklungsgenetishe Grenzen sihtr mhen (.., ). Die Grenze zwishen dem nterioren und posterioren Komprtiment des. Thorxsegments stellt sih ls gerde Linie ohne Bezug uf die ntomie der Flügelvenen dr. ie esteht in dieser Form sowohl uf der dorslen wie der ventrlen eite des Flügels. Etws später werden die dorsle und die ventrle eite durh eine weitere Komprtimentsgrenze getrennt. hwingkölhens (Hltere) wr ein kleiner Flügel differenziert. Er nnnte diese Muttion ithorx (x). Es wr die erste von vielen so gennnten homeotishen Muttionen. Diesen Muttionen ist gemeinsm, dss sie, z. B. ei der Fliege zu einer Differenzierung vorhndener trukturen m flshen Ort führen. Die Funktion von x + ist mitverntwortlih dfür, dss im egment T eine Hltere geildet wird. Fehlt diese Funktion, wird eine truktur eines nderen egments, hier des Nhrsegments T differenziert. Die homeotishen Gene werden uh ls homeotishe elektorgene ezeihnet, weil sie ds Entwiklungsshiksl für jedes einzelne egment uswählen und estimmen. Wie im Folgenden gezeigt wird, sind sie die Kontrollgene der egmentdifferenzierung. Edwrd B. Lewis ht sih viele Jhrzehnte mit den Genen und ihren Muttionen im später so gennnten Bithorx-Komplex (BX-C) efsst. Er fnd Muttionen, die uf drstishe Weise ds dritte Thorxsegment T und die dominlsegmente verändern. Zum Teil eziehen sih die Muttionen entweder uf ein nteriores oder ein posteriores Komprtiment. o ist der hänotyp der Doppelmutnte ithorx postithorx (x px) eine vierflügelige Fliege (..5). Ds gesmte egment T wird in T trnsformiert. Mn spriht von einer homeotishen Trnsformtion. Fliegen, die mutnt für ithorxoid (xd) sind, hen 8 Beine, d ds 1. dominlsegment 1 in T umgewndelt wurde. Dies sind Bei- spiele für rezessive loss-of-funtion(verlust)-muttionen. Ihnen ist gemeinsm, dss ein egment trukturen differenziert, die normlerweise zu einem nterior gelegenen egment gehören. Demgegenüer stehen die dominnten gin-of-funtion(zugewinn)-muttionen, die in einem egment trukturen differenzieren, die zu einem posterior gelegenen egment gehören. Mit Contrithorx (Cx) und Hltere-mimi (Hm) knn mn genetish Fliegen mit Hlteren konstruieren, weil T in T trnsformiert wird. ll diese Gene sind in einem kleinen shnitt des. Chromosoms von Drosophil loklisiert, im olytänhromosom im shnitt 89E. Die genetishe Feinkrtierung ht ergeen, dss die Gene uf dem Chromosom in derselen Reihenfolge ngeordnet sind, wie sie im Orgnismus entlng der Körperhse wirken. Einige dieser Gene sind in der oeren Hälfte der..6 eingetrgen. us seinen Experimenten ht Lewis ein Modell entwikelt, nhdem usgehend von einem Grundzustnd T in jedem nhfolgenden egment T ein weiteres Gen des BX-C ktiv wird und nh posterior in llen nderen egmenten ktiv leit. Wird durh eine Deletion der gesmte Genkomplex entfernt, zeigt ds Kutikulmuster einer solhen Lrve von T is 8 einheitlih die Zähnhenänder von T. Die molekulre nlyse des BX-C ht ergeen, dss der Komplex us nur drei Genen esteht: Ultrithorx (Ux), dominl- (d-) und dominl-b (d-b). Die von Lewis gefundenen Gene erwiesen sih ls regultorishe Elemente, die in der rund 00 k BX-C-DN verteilt sind. Die Kolinerität der Reihenfolgen dieser Enhner und ihrer segmentspezifishen Wirkungen im Emryo ist uh uf dieser Eene estätigt worden (..6). Die Expressionsdomänen der homeotishen Gene werden von Gpund rregelgenen mitestimmt. llerdings sind die molekulren Detils noh weitgehend uneknnt. Mn weiß er, dss z. B. die Gene d- und d-b durh Hunhk und Krüppel reprimiert werden, und dss Ux durh estimmte Hunhk-Konzentrtionen ktiviert wird. Bei der Festlegung der rsegmentgrenzen ls Expressionsgrenzen spielen die rregelgene fushi-trzu und even-skipped eine Rolle. x x xd px i- i- i- i-5 i-6 i-7 i-8 i k H H ' H 5' ' 5'' 5' ' 5' 5' ' ' 5' Ux d- d-b..5 Vierflügelige Drosophil Fliege. Rehte Hälfte des Thorx mit Flügel (Mesothorx T ) und Hltere (Metthorx T ). In der Doppelmutnte ithorx postithorx (x px) wird ds T - perfekt in ds T -Thorxsegment trnsformiert [Bild von Ernesto nhez-herrero, Mdrid]...6 Der Bithorx-Komplex (BX-C). In der oeren Hälfte sind einige der von Edwrd Lewis krtierten Muttionen von x is i-9 eingetrgen. Die feile verinden die Nmen der Muttionen mit denjenigen egmenten, in denen sie homeotishe Trnsformtionen hervorrufen. Gene und egmente sind koliner. In der unteren Hälfte sind die molekulren Dten verkürzt drgestellt. Die roteine der Gene Ux, d- und d-b sind Trnskriptionsfktoren mit jeweils einer DN-indenden Homeoox (H). (Es git jeweils mehrere Trnskripte.) Die Zuordnung zu den egmenten, in denen sie wirksm sind, ist frlih mrkiert. x = nteroithorx, i = infr-dominl. ndere Bezeihnungen s. Text [nh Gehring 001].