Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik. Ausarbeitung zum Vortrag im Rahmen des Hauptseminars Experimentalphysik

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1 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Ausabeitung zum Votag im Rahmen des Hauptseminas Expeimentalphysik Physikalische Gundlagen in de medizinischen Diagnostik an de Univesität Duisbug-Essen Standot Duisbug SS 006 Macel Ruth Essen, Juli 006 Beteue: D. Kleinefeld

2 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik GLIEDERUNG: 1. EINLEITUNG / MOTIVATION... 3 LASER Was ist ein Lase? Elektomagnetische Stahlung Kohäenz Absoption, spontane und induziete Emission Lebensdaue, Ratengleichungen Besetzungsinvesion, Lasemedium / aktives Medium Pumpen Linienbeite Lase-Resonato, Lasemoden Laseschwelle Lase-Systeme, Helium-Neon-Gas-Lase LASER INDUZIERTE FLUORESZENZ Physikalische Gundlagen Enegieniveaus bei Molekülen Optische Übegänge Fanck-Condon-Pinzip Fluoeszenz Methode Anwendungen HIV und Leukämie Diagnose mit dem Duchflusscytomete Speiseöhenkebs Diagnostik Spemiensotieung mit dem Duchflusscytomete Immunfluoeszenz LASERTOMOGRAPHISCHES SCANNEN (LTS) Methode Anwendungsbeeiche Netzhautscanning (Lase-Scanning Ophthalmoscope) Gewebe Lase-Mikoskopie Bodyscanning OPTISCHE KOHÄRENZTOMOGRAPHIE (OCT) Physikalische Gundlagen Elektomagnetische Wellen, Intensität, Intefeenz Michelson-Intefeomete Lichtquellen kuze Kohäenzlänge, Auflösung Methode Anwendungsbeeiche Ophthalmologie Dematologie Uologie und HNO-Heilkunde Zahnheilkunde Vo- und Nachteile de OCT RESUME - PERSPEKTIVE QUELLEN- UND LITERATURVERZEICHNIS Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite:

3 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik 1. Einleitung / Motivation Die Medizin ist stets auf de Suche nach nicht-invasiven Vefahen zu möglichst fühzeitigen Diagnose von Kankheiten. Diese Vefahen sollten zum Einen zuvelässig Infomationen übe das Untesuchungsobjekt liefen und zum Andeen möglichst unpoblematisch sein. D.h. de Patient sollte in möglichst kuze Zeit möglichst unkompliziet untesucht weden können. Hiebei können unnatüliche, kohäente Lichtquellen eine nützliche Hilfe sein. Solche sind insbesondee de Lase, welche sich aufgund einige Eigenschaften seh gut fü einige Anwendungen eignet: - schafe Bündelung De Lase ist aufgund de schafen Bündelung des Stahls fü Vemessungs- und Scannvefahen gut geeignet (z.b. Lasetomogaphisches Scannen). - äumliche und zeitliche Kohäenz Duch die hohe Kohäenz de Lasestahlung ist die Bestimmung geometische seh geinge Längenunteschiede in de Intefeometie möglich (z.b. Optische Kohäenztomogaphie (nutzt hohe äumliche Kohäenz, alledings gewollt kuze Kohäenzlängen modifiziete Lase)) - Monochomasie Da ein Lase seh monochomatisch ist, können gezielte Anegungen im zu untesuchenden Gewebe gemacht weden. Duch die Analyse de vom Gewebe wiede ausgesandten Fluoeszenzstahlung können Aussagen übe dessen At gemacht weden (laseinduziete Fluoeszenz) - hohe Enegiedichte Die hohe Enegiedichte elaubt es den Lase übe die Diagnostik hinaus auch in de Theapie z.b. als Schneidewekzeug zum Entfenen von u. a. Tumoen ode als Schweißwekzeug zum Anschweißen eine losgelösten Netzhaut einzusetzen. Seit einigen Jahen gibt es Vefahen, die dank diese Lichtquelle dem Patienten unangenehme Eingiffe, die Risiken und Nebenwikungen haben, espaen. In diesem Votag weden dei unteschiedliche Vefahen dagestellt und die zugunde liegende Physik sowie Anwendungsgebiete eläutet: Lasefluoeszenzspektoskopie Lasetomogaphisches Scannen Optische Kohäenztomogaphie Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 3

4 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Lase.1 Was ist ein Lase? Das Wot Lase ist ein Akonym und steht fü: Das bedeutet: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation Licht-Vestäkung duch stimuliete Emission von Stahlung De Lase ist eine Lichtquelle und wikt als Oszillato und Vestäke fü monochomatisches sichtbaes, infaotes und ultaviolettes Licht. E beuht auf dem gleichen Pinzip wie de im Mikowellenbeeich abeitende Mase (Micowave Amplification by Stimulated Emission of Radiation). Man kann heutzutage Lase alle Wellenlängen zwischen 1µm und 3mm bauen, wobei ihe Leistung zwischen 1µW und 1TW liegt. Auch die Maße eines Lases vaiieen seh stak, so gibt es Halbleitelase, die kleine als 1mm, und Fusionslase, die göße als 100m sind. ν λ Abb.: Fequenz- und Wellenlängenspektum elektomagnetische Stahlung [31] Die Stahlung eines Lases ist in de Regel in einem engen Stahl gebündelt, de sich nu aufgund von Beugungseffekten geingfügig aufweitet (z.b. 600nm Lasestahl von mm Duchmesse auf 3cm Duchmesse in 100m Entfenung). Zudem ist sie unte Umständen auch extem monochomatisch. Das Vehältnis von abgegebene Stahlungsleistung zu aufgewendete elektische Leistung ist de Wikungsgad eines Lases und liegt häufig bei unte 0,1% (es gibt abe auch Lase mit Wikungsgaden bis zu 40%). Obwohl die Ausgangsleistung viele Lase seh geing ist (z.b. 1mW beim He-Ne-Lase), eeicht man aufgund de staken Fokussieung seh hohe Stahlungsintensitäten (z.b. 1GW/cm = 1TW/m ). Diese können bei gepulsten Lasen kuzzeitig Wete von W/m eeichen. Die entspechenden elektischen Felde haben dann Stäken von etwa 60 MV/m bzw. 60 GV/m beim gepulsten Lase. Das Licht des Lases entsteht in de Regel duch Übegänge von Elektonen aus enegetisch angeegten Atomzuständen, die duch eine Lichtwelle geeignete Fequenz stimuliet bzw. induziet weden, wähend konventionelle Lichtquellen Licht nu duch spontane (zeitlich und äumlich unkoeliete Übegänge aussenden. Beim Lase übelaget sich das ezeugte Licht mit de eegenden Lichtwelle phasengleich, mit gleiche Polaisation und in gleiche Richtung. Die Lichtwelle wid somit kohäent vestäkt. Dieses ist alledings nu dann möglich, wenn meh Atome im angeegten, als im Gundzustand voliegen, da dann die induziete E- Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 4

5 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik mission gegenübe de Absoption übewiegt. Diese Zustand wid als Besetzungsinvesion bezeichnet. Bei zwei Niveau-Systemen ist dieses nicht möglich. Hie ist die Wahscheinlichkeit de Emission genauso goß wie die de Absoption, so dass sich höchstens genauso viele Atome im angeegten Zustand befinden, wie im Gundzustand. Das sog. Lasemedium hat somit also mindestens dei Niveaus. Die Anegung des Lasemediums geschieht duch das sog. Pumpen.. Elektomagnetische Stahlung Ebenso wie Mikowellen, Radiowellen, Röntgen- und γ-stahlung ist Licht eine elektomagnetische Welle. Auch das Laselicht ist im gesamten Wellenlängenbeeich von 1µm bis 3mm eine elektomagnetische Welle, deen elektische und magnetische Felde E und B duch die Maxwell-Gleichungen (im Vakuum) beschieben weden: div ot ( E) = E = ρ ε 0 div ( B) = B = 0 1 ( E) = E = B ot( B) = B = E + µ j Aus den Maxwell-Gleichungen folgen die Wellengleichungen: ot( E) E = B ot ot( E) = & & = ot & E = ot B ( ) ( ) ( ) Mit de bac-cab Regel egibt die linke Seite: ( E ) = ( E ) c 0 ρ ε 0 & 0 { E( ) = ( ρ ) + E ε 1 Und die echte Seite ist: ot( B) = ( B) = ( B) = ( E + µ j ) Fü ρ = j = 0 gehen die Gleichungen übe in: ρ =0 ( ) + E = E ε 0 & t t 13 1 & E+ µ 0 j c ( ) ( ) ρ E + µ j = E = E t c t 0 j = 0 t t c c t t 0 c t 1 E = E E + 1 E & = c 0 c t Analog folgt die Wellengleichung fü das magnetische Feld B: 1 & ot( B) = B = E + µ 0 j ot c 1 & 1 & ot( ot B ) = ( B) = ot E + µ 0 j = E + µ j 0 c c B B B = ( ) Mit de bac-cab Regel egibt die linke Seite: ( ) ( ) { ( ) = B Und die echte Seite ist: ( E + µ j ) = ( E) + µ ( j ) = B + µ ( j ) c t 0 Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 5 c t 13 B t 0 0 c t 0

6 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik 1 1 Fü ρ = j = 0 geht die Gleichungen übe in: B + µ ( j ) = B c t 0 j = 0 c t 1 B = B B + 1 B & = c 0 c t Die Wellengleichungen weden duch die Gleichungen ebene Wellen gelöst: i k ωt i E, t = E e und ( ) ( k ωt B, t = B e ) ( ) ( ) 0 Hiebei sind E 0 und B 0 die Amplituden, k -ωt ist die Phase. k ist de Wellenvekto und ω die Keisfequenz. Duch Einsetzen in die Maxwellgleichungen lässt sich die Tansvesalität de elektomagnetischen Wellen zeigen: ρ E = ε 0 B = 0 ρ = 0 = 0 E B ( ) i k t i = ( k t e ik E e ) ω ω = ik E 0 0 = ( ) i k t i = ( k t e ik B e ) ω ω = ik B 0 0 = k E k B D.h. das elektische und das magnetische Feld oszillieen senkecht zueinande senkecht zu Ausbeitungsichtung de Welle, welche duch den Wellenvekto k beschieben wid. k.3 Kohäenz B Abb.: Momentanbild eine Elektomagnetischen Welle, die sich in x-richtung ausbeitet [N9] Die Fähigkeit unteschiedliche Wellen stationäe Intefeenzescheinungen hevozuufen wid - abgeleitet vom lateinischen cohaeee 1 - mit Kohäenz bezeichnet. Andes ausgedückt: Zwei ode mehee Wellen sind genau dann kohäent, wenn sie zeitlich unveändeliche Intefeenzphänomene ezeugen können. Dazu ist eine zeitlich konstante Phasendiffeenz de Wellen nötig. i ( ) ( k ωt ) i( ϕ ) E1, t = E01 e = E01 e i k ωt+ ϕ i ϕ + ϕ t = E e = E e ( ) ( ) ( ) E, 0 0 Bei inkohäentem Licht addieen sich in de Regel die Intensitäten zweie unteschiedliche Lichtquellen, die an de gleichen Stelle aufteffen: I = I 1 + I 1 cohaeee = zusammenhängen Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 6

7 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Bei kohäentem Licht hingegen lassen sich Intefeenzen zweie elektomagnetische Wellen mit gleiche Wellenlänge λ = c / ν, Phasendiffeenz φ und Intensitäten I 1 und I beobachten. Die Intensität an einem Ot ist dann: I = I + + π s 1 I I1I cos + ϕ λ Hiebei wid de zusätzliche Tem als Intefeenz- ode Modulationstem bezeichnet. s ist die Wegdiffeenz zwischen beiden Wellen (siehe auch 5.1). Man untescheidet zwischen zeitliche und äumliche Kohäenz. 1.) zeitliche Kohäenz Ein Maß fü die zeitliche Kohäenz elektomagnetische Wellen ist die Länge eines Wellenzuges, die sog. Kohäenzlänge L c. Die Kohäenzlänge ist definiet als maximale Wellenlängenunteschied s max, bei dem man den Modulationstem noch beobachten kann. Da die Geschwindigkeit de elektomagnetischen Welle im Vakuum die Lichtgeschwindigkeit c ist, lässt sich aus de Kohäenzlänge die Kohäenzzeit beechnen: L c c = τ c τ c = L c c Die Kohäenzzeit ist mit de spektalen Fequenzbeite ν de elektomagnetischen Welle veknüpft: 1 c ν = = πτ π c L c Die Kohäenzlänge L c de Stahlung eine Lichtquelle wid also umso göße, je kleine die spektale Halbwetsbeite ν de emittieten Stahlung ist. Damit ist die zeitliche Kohäenz ein Maß fü die spektale Reinheit de elektomagnetischen Stahlung. Zu Veanschaulichung sind in de folgenden Tabelle Kohäenzlänge L c, Kohäenzzeit τ c und Bandbeit ν einige Stahlungsquellen im diekten Vegleich dagestellt: λ = c / ν in [µm] L c in [m] τ c in [s] ν / ν Ne 0, , Niededuckspektallampen -7 K 0, Cd 0, , , Lase He-Ne 0, ,6 10-3, Tabelle: Vegleich de Kohäenz bekannte Spektallampen mit dem He-Ne-Lase [6] Abb.: Zeitliche Kohäenz [39] Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 7

8 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik.) äumliche Kohäenz Unte äumliche Kohäenz vesteht man die Fähigkeit eine Lichtquelle zu gleichen Zeit an veschiedenen Oten stationäe Intefeenzphänomene hevozuufen. Vedeutlichen kann man dieses anhand des Young schen Doppelspalt-Expeimentes, mit welchem man die äumliche Kohäenz auch messen kann. Abb.: Skizzen zu Vedeutlichung de äumlichen Kohäenz [3] a) äumlich ausgedehnte Lichtquelle LQ, deen Licht auf einen Doppelspalt A fällt b) Wegstecken des Lichtes zu den beiden Spalten Hiebei beleuchtet die Stahlung eine paallel zu Doppelspaltebene A in de Länge b ausgedehnte Lichtquelle die zwei Spalte S 1 und S. Die Intensität im Punkt P in de Beobachtungsebene B hängt zum Einen von de Wegdiffeenz S 1 P-S P und zum Andeen von de Phasendiffeenz φ in den beiden Punkten S 1 und S ab. Die Phasen in den Punkten setzen sich aus den Teilphasen von den einzelnen Flächenelementen df de Quelle unte Beücksichtigung de veschiedenen Weglängen dfs 1 bzw. dfs zusammen. Schwankt die Phasendiffeenz φ zwischen den Gesamtamplituden in S 1 und S bei statistische Emission de veschiedenen Quellenpunkte Q um meh als π, so wid sich die Intefeenzstuktu in Ebene B zeitlich wegmitteln. Dieses ist de Fall, wenn in Abb. b) die Wegdiffeenz S R = b sin(θ/) göße als λ/ wid. Die Bedingung fü eine kohäente Beleuchtung de Spalte lautet also: θ d θ d Mit R sin( ) = sin ( ) = R θ λ b d ( ) = b sin < bd λ < b R d R = F dω < λ R s = b sin θ ( ) < λ Das bedeutet also, dass je göße die Fläche F = b de Lichtquelle ist, desto kleine wid de Raumwinkel dω, innehalb dessen die ausgesandte Stahlung äumlich kohäent ist. Abb.: Räumliche Kohäenz [39] Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 8

9 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik.4 Absoption, spontane und induziete Emission Atome und Moleküle liegen in de Regel im stabilen Gundzustand, d.h. dem enegetisch günstigsten Zustand vo. Im Gundzustand können sie keine Enegie abgeben. Jedes Atom und Molekül besitzt jedoch weitee Zustände, deen Enegien göße als die des Gundzustandes sind. Duch Zufuh von Enegie können die Atome und Moleküle in einen sog. angeegten Zustand übegehen. Diesen Vogang nennt man Absoption, da die dazu notwendige E- negie von andeen Teilchen kommt, insbesondee von feien Elektonen, ode Lichtquanten, den sog. Photonen, welche von dem Atom ode dem Molekül absobiet weden. Absoption: E angeegte Zustand Ein Elekton im Gundzustand absobiet ein Photon mit de Enegie hν und wid damit aus dem Gundzustand E 1 in einen enegetisch höheen (angeegten) Zustand E angehoben. E hν E 1 Gundzustand De umgekehte Vogang ist die Emission. Sie geschieht plötzlich und unkoeliet und wid dahe als spontane Emission bezeichnet. Hiezu muss sich das Atom ode das Molekül in einem angeegten Zustand befinden, um seine Enegie in Fom eines Photons wiede abzugeben: Spontane Emission: E angeegte Zustand Ein Elekton im angeegten Zustand E fällt spontan in einen enegetisch tiefeen Zustand (z.b. den hν Gundzustand) E 1 zuück und gibt die Enegiediffeenz E = E E 1 = hν in Fom eines Photons ab. E 1 Gundzustand 1917 postuliete Einstein die induziete Emission von Licht, was die physikalische Gundlage fü den Lase ist. Bei diesem Vogang bleibt das einfallende und induzieende Photon, andes als bei de Absoption ehalten, und egt das angeegte Atom ode Molekül zu Abegung an. Das emittiete Photon hat die gleiche Wellenlänge, Phase, Polaisation und Ausbeitungsichtung wie das induzieende Photon und vestäkt dieses somit kohäent. E Induziete Emission: Das einfallende Photon de Fequenz hν egt das das Elekton zu Abegung an, welches bei dem Übegang von E nach E 1 ein in allen Quantenzahlen dem induzieenden Photon entspechendes Photon aussendet. E E 1 E angeegte Zustand hν hν hν Gundzustand Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 9

10 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik.5 Lebensdaue, Ratengleichungen Die Wahscheinlichkeit de spontanen Emission, also die Wahscheinlichkeit, dass po Sekunde ein Photon von einem angeegten Atom ode Molekül beim Übegang vom Enegieniveau j nach i spontan emittiet wid, wid duch den sog. Einsteinkoeffizienten A j i = A ji beschieben. Ist das Enegieniveau E j mit de Besetzungszahl N j besetzt, so ist die Abnahme de Besetzungszahl dn j po Zeitintevall dt gegeben duch: dn j = A ji N j dt Duch Tennung de Vaiablen und anschließende Integation folgt die Gleichung fü die Besetzungsdichte in Abhängigkeit von de Zeit und de anfänglichen Besetzungszahl N j0 bei t=0: N j ~ ~ 1 dn t = j N N j 0 j 0 A ji ~ dt N j ln = A ji t N j0 N j = N j0 e A t ji Die mittlee Lebensdaue τ 0 des angeegten Zustandes N j ist definiet als de Kehwet de Summe alle Übegangswahscheinlichkeiten von diesem Zustand aus: τ 0 = Die oben stehende Gleichung wid Ratengleichung genannt und in de Regel in folgende Fom geschieben: dn j = Aji N j dt So kann man fü jedes Enegieniveau eine Ratengleichung sowohl fü die Emission, als auch fü die Absoption fomulieen. Bei einem duch ein Stahlungsfeld hevogeufenen, also induzieten Übegang (Absoption ode Emission) ist die Wahscheinlichkeit fü den Übegang auch stak von de spektalen Enegiedichte ρ(ν) des Stahlungsfeldes abhängig und wid dahe nicht mit dem Einsteinkoeffizienten A ji, sonden mit ρ(ν) B ij beschieben: 1 A ji dn dt j = ρ ( ν ) B ji N j B ij ist auch hie eine Konstante, welche die Wahscheinlichkeit fü den Pozess bescheibt. In einem veeinfachten Modell zu Bescheibung de Vogänge Emission und Absoption von Licht haben viele gleichatige Atome Elektonen in nu zwei (nicht entateten) Zuständen. Im Gundzustand haben sie die Enegie E 1 und im angeegten Zustand die Enegie E. Ist N 1 nun die Zahl de Atome im Gundzustand und N die Zahl de Atome im angeegten Zustand und tifft eine Lichtwelle mit de Fequenz ( E E1 ) ν 1 = h und de spektalen Enegiedichte ρ(ν) auf die Atome, so wid diese z. T. absobiet. Bei de Absoption gehen die Elektonen aus dem Gundzustand E 1 in den angeegten Zustand E Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 10

11 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik übe, da die Lichtwelle genau die entspechende Enegie E = hν 1 = E - E 1 besitzt. Po Zeiteinheit ist die Anzahl de angeegten Atome dabei dn dt ( ) B 1 1 = N 1 ρ ν. In diese sog. Ratengleichung ist B 1 eine Konstante, die die Wahscheinlichkeit fü den Absoptionspozess, also den Übegang de Atome von 1 nach angibt. In de gleichen Zeit finden umgekeht abe auch Emissionspozesse statt, die z. T. spontan sind, und von de endlichen Lebensdaue de angeegten Zustände he ühen. Nach Einstein folgt aus de mikoskopischen Umkehbakeit des Absoptionspozesses, dass auch Übegänge von nach 1 duch die einlaufende Lichtwelle induziet weden. Die Anzahl de Atome, die po Zeiteinheit in den Gundzustand übegehen, ist damit: dn dt ( A + ρ( ν ) B ) = N 1 1. A 1 ist hie die Konstante, welche die Wahscheinlichkeit fü die spontane, und B 1 die Konstante, welche die Wahscheinlichkeit fü die induziete Emission angeben. Im themischen Gleichgewicht de Atome mit de Stahlung sind die sog. Besetzungszahlen N 1 und N zeitlich konstant, es finden also genauso viele Emissions- wie Absoptionspozesse statt. Das Vehältnis N /N 1 ist dabei duch den Boltzmann-Fakto gegeben: E E N N 1 hν = exp. k BT T 0 = 0K T 0 < T < T 3 T < T 3 < T 4 T 4 = E 1 Abb.: Anzahl de Atome eines -Niveausystems im angeegten und im Gundzustand bei unteschiedlichen Tempeatuen gemäß de Boltzmann-Veteilung Da im themischen Gleichgewicht dn 1 dn = ist, gilt fü die spektale Enegiedichte ρ(ν): dt dt e 1 = hν kbt dn dt dn dt 1 = N 1 ρ( ν ) B 1 = = N ( A1 + ρ( ν ) B1 ) ρ( ν ) B1 N = ( A1 + ρ( ν ) B1 ) N1 ( A1 + ρ( ν ) B1 ) A1 B1 = + ρ( ν ) B1 ρ( ν ) B1 B1 ( ν ) 1 = hν kbt B1 e B 1 mit N N 1 hν = exp k BT B 1 e hν k T B B 1 = A ρ (spektale Enegiedichte) 1 A1 ρ ν ( ) Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 11

12 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Die Koeffizienten A und B lassen sich nun noch duch den Vegleich mit de Plankschen Stahlungsfomel bestimmen: h c 1 ES ( λ, T ) = π (Emissionsvemögen); 5 h c λ λ kbt e 1 mit c = λ ν λ = c / ν egibt sich: 3 8πhν A1 = B 3 1 und B 1 = B1. c Das Zahlenvehältnis von induzieten zu spontanen Emissionspozessen themische Stahle egibt sich somit zu: ρ( ν ) B1 1 =. hν A1 kbt e 1 Im sichtbaen Beeich des Spektums ist dieses Vehältnis seh klein (10-5 fü T = 000K und λ = 600nm), was bedeutet, dass dot themische Stahle wie Glühbinen fast nu duch spontane Emissionen Licht abgeben. Zudem ist bei themischen Stahlen auch nu ein seh geinge Buchteil de Atome im angeegten Zustand (N /N ), und somit die Zahl de Absoptionspozesse deutlich höhe, als die de induzieten Emission. Da (N 1 N )ρ(ν)b 1 also positiv ist, wid die eegende Lichtwelle stets geschwächt. Um die Lichtwelle duch induziete Emission zu vestäken, muss N > N 1 sein, was nu bei de sog. Besetzungsinvesion möglich ist..6 Besetzungsinvesion, Lasemedium / aktives Medium Um eine Besetzungsinvesion, also ein übebesetztes, angeegtes Niveau zu ealisieen, ist also ein System nötig, das aus mindestens dei Niveaus besteht. Dieses System ist das sog. Lasemedium. Dabei eignet sich noch lange nicht jedes System mit meh als zwei Niveaus zum Bau eines Lases, da eine Besetzungsinvesion nu dann möglich ist, wenn ein mittlees Niveau metastabil ist und Atome sich somit länge in diesem Zustand, als im angeegten Zustand vebleiben. 3-Niveau-Lase: E 3 E E 1 E angeegte Zustand Gundzustand hν Zu Ezeugung von Besetzungsinvesionen sind zudem nicht nu zwei, sonden mindestens dei Enegieniveaus E 3 > E > E 1 notwendig. Die Pumpenegie bewikt dabei einen Übegang von 1 nach 3, wobei die Invesion N 3 > N 1 eeicht wid, wenn diese Übegang optisch veboten ist (nach den Auswahlegeln fü Dipolstahlung). In diesem Fall kann das System nu übe den Zustand in den Gundzustand 1 zuückkehen. Duch einen stahlungslosen Übegang von 3 nach (mit kleine Enegiediffeenz) ist dann auch eine Besetzungsinvesion de Zustände und 1 möglich, wobei de Übegang von nach 1 als Lase- Übegang fungiet. Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 1

13 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik 4-Niveau-Lase: E 4 E angeegte Zustand Das Stahlungsfeld ρ passt nu genau auf den Übegang 1 4, dahe weden nicht auch die andeen Niveaus angeegt. E 3 E Gundzustand hν De 4-Niveau-Lase funktioniet ähnlich wie de 3 Niveau Lase, nu mit 4 anstelle von 3 Niveaus. Das viete Niveau liegt dabei zwischen dem übebesetzten Lase- und dem Gundzustand, so dass die Elektonen beim Laseübegang in dieses Niveau übegehen und est von dot aus in den Gundzustand zuückkehen. Von dot aus weden sie dann wiede in das Niveau E 4 angeegt. E 1 Als Lasemedium kommen viele unteschiedliche Substanzen in Fage. Sie liegen soga in völlig unteschiedlichen Aggegatzuständen vo. Zum Beispiel: Lasetyp Lasemedium Aggegatzustand He-Ne-Lase (Helium,) Neon gasfömig Fabstoff(Dye-)lase Fabstoffmoleküle flüssig Rubin-, Nd:YAG-, Titan-Saphi-Lase Kistalle (Rubin, Nd:YAG, Titan-Saphi) fest.7 Pumpen Um duch induziete Emission Lichtvestäkung zu bewiken, muss dem Lasemedium Enegie (die sog. Pumpenegie) zugefüht weden. Wähend bei Flüssigkeiten und Festköpen diese Enegie duch Licht eingestahlt wid, efolgt die Zufuh von Enegie bei Gaslasen duch Elektonenstöße in eine elektischen Gasentladung. Bei einem 3-Niveau-Lase bewikt die Pumpenegie den Übegang von 1 nach 3, bei einem 4 Niveaulase den Übegang von 1 nach 4. De Übegang in andee Niveaus findet nicht statt, da die Pumpenegie genau de Diffeenz entspicht. E Pump = E 3 E bzw. 4 1 De Vogang de Zufühung de Pumpenegie wid mit Pumpen bezeichnet. Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 13

14 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Pumppozesse bei unteschiedlichen Lasen (Übesicht): Gaslase Festköpe- und Fabstofflase Halbleitelase chemische Lase Stoßanegung de Atome, Ionen ode Moleküle in Gasen und Plasmen Anegung duch extene, elektomagnetische Stahlung, d.h. duch sog. optisches Pumpen Anegung duch Stomduchgang, d.h. Ladungstägeinjektion in Halbleiten Chemische Reaktionen.8 Linienbeite Die von einem Lasemedium emittieten Photonen sind nicht 100% monochomatisch. Dei mögliche Pozesse vebeiten das Emissionspofil: Natüliche Linienbeite: Aufgund de Heisenbegschen Enegie-Zeit-Unschäfeelation ist die Enegie bei eine Lebensdaue τ des Zustandes nu auf E = h / πτ genau bestimmba. Daaus esultiet die Unschäfe de entspechenden Fequenz ν = E / h = 1 / πτ und somit ein vebeitetes Emissionspofil. Stoß- / Duckvebeiteung: Bei manchen Lasemedien ist es möglich, dass duch Stöße stahlungslos Enegie den Molekülen entzogen ode hinzugefügt wid. Daduch vekleinet bzw. vegößet sich die Enegiediffeenz beim Laseübegang und es kommt zu Aufweitung des Emissionspofils. Die Enegiediffeenz wid in Rotations-, Vibations- ode Tanslationsenegie umgewandelt. Dopplevebeiteung: Da sich die Atome bzw. Moleküle des Lasemediums je nach Aggegatzustand und Tempeatu meh ode wenige in Bewegung befinden geschieht gemäß dem Dopple-Effekt eine Fequenzehöhung bei eine Relativbewegung in Emissionsichtung und eine Fequenzeniedigung bei entgegengesetzte Bewegung..9 Lase-Resonato, Lasemoden In einem Lase wid das Licht duch eine Anodnung zweie Spiegel imme wiede duch das Lasemedium (das Gebiet, in dem Besetzungsinvesion hescht) geleitet. Von dem lateinischen Wot esonae (= zuücksingen, hallen) abgeleitet, nennt man dieses einen optischen Resonato. Im Resonato wid das Licht beim Hin- und Helaufen zwischen beiden Spiegeln imme weite vestäkt, bis de Leistungszuwachs innehalb des Systems duch die Abnahme de Besetzungsinvesion und die imme stäke ansteigenden Veluste ausgeglichen wid. Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 14

15 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Um das Laselicht zu Anwendung aus dem Resonato auszukoppeln, ist mindestens eine de beiden Spiegel teilweise duchlässig. Dabei bescheibt man die Duchlässigkeit de Spiegel mit dem Reflexionskoeffizienten R fü die Intensität. R = 1 = 100% : totale Reflexion / keine Tansmission R = 0 = 0% : totale Tansmission / keine Reflexion (voausgesetzt es gibt im Spiegel keine Absoption) Wie oben beeits angespochen, muss bei einem Umgang des Lichtstahls duch den Resonato die Vestäkung die Veluste (inklusive de Auskopplung) mindestens kompensieen ode soga übeteffen. Somit liegt de Reflexionskoeffizient je nach Lase zwischen etwa 85% und 99%. Hiebei ist die Geometie de Spiegel keineswegs ielevant. Sie entscheidet daübe, ob ein Resonato optisch stabil ode instabil ist. Häufig wählt man konfokale Spiegel und ehält damit folgendes Stahlungsfeld: Faby-Péot Resonato mit planaen Spiegeln: Abb.: Stahlungsfeld eines konfokalen Resonatos [6] Abb.: Stahlungsfeld im Resonato [6] Hemisphäische Resonato: Konfokale Resonato: stabil instabil Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 15

16 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Lasemedien mit seh hohe Vestäkung können auch mit nu einem Spiegel ode ganz ohne Spiegel lasen (Supestahle, z.b. Stickstofflase). Mit dem Resonato lassen sich zudem einige Eigenschaften de Lasestahlung einstellen: 1) Wellenlänge Die Wellenlänge de Lasestahlung hängt zunächst vo allem von dem benutzten Lasemedium ab. Gibt es in einem solchen Medium alledings mehee Laseübegänge (z.b. He-Ne-Lase (vgl..8 Abb. )), so lässt sich eine duch die Länge des Resonatos auswählen: Die Länge des Resonatos L muss um eine Vestäkung zu bewiken einem ganzzahligen Vielfachen de halben Lasewellenlänge entspechen: λ L = n ; n = 1,,3,... Genau dann kann sich im Resonato eine stehende Welle ausbilden. Duch die Übelageung de induzieten Wellen wid das Licht eben diese einen Fequenz vestäkt. Resonatolänge L Spiegel 1 Spiegel λ / Auf ein und dieselbe Resonatolänge L passen mehee stehende Wellen, deen Wellenlänge dann abe entspechend unteschiedlich ist. Resonatolänge L Spiegel 1 Spiegel λ / λ / Diese unteschiedlichen stehenden Wellen nennt man Resonato-Moden. Da die spektale Bandbeite ν bei einem atomaen Übegang deutlich beite als de Modenabstand ist, schwingt de Lase in veschiedenen Moden: Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 16

17 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik I I Pofil eines spontanen atomaen Übegangs ν Resonatomoden ν Ein Lase hat demnach in de Regel ein Modenspektum, das wie folgt aussieht: I γ th Laseschwelle (siehe unten) Duch intefeometische Bauteile wie sog. Etalons lässt sich ein Monomodenbetieb, also ein Betieb, bei dem de Lase nu die Wellenlänge eine Mode emittiet bewekstelligen. ) Polaisation Zwischen den beiden Spiegeln des Resonatos gibt es die Möglichkeit das Lasemedium duch einen Glaszylinde äumlich zu begenzen. Duch kippen de Fenste im Bewste- Winkel lässt sich das Laselicht linea polaisieen, da, wenn ein Lichtstahl unte dem Bewste- ode auch Polaisationswinkel auf eine Genzfläche tifft, de eflektiete Teil vollständig linea polaisiet ist. In diesem Fall bilden eflektiete und tansmittiete Stahl einen echten Winkel. ν Spiegel 1 Spiegel Bewstefenste Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 17

18 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik.10 Laseschwelle Da pimä duch Auskopplung, abe auch duch andee Pozesse Veluste entstehen, beginnt ein Lase est ab eine bestimmten Intensität zu abeiten, bei de diese Veluste kompensiet weden. Diese Intensität nennt man Laseschwelle. Beücksichtigt man die Veluste duch Auskopplung in den Reflektionskonstanten R Spiegel1 und R Spiegl, sowie sämtliche andee Veluste in de Velustkonstanten α(n), so ist die Intensität nach einem Umlauf in einem Resonato de Länge L gegeben duch: ( ) L I L = I 0 e γ ν α ν R R ( ) ( ) ( ) ( ) ν ν Spiegel1 Spiegel1 γ(ν) ist hiebei de Vestäkungsfakto. Da die Vestäkung die Veluste kompensieen muss, also die Intensität nach einem Umlauf gleich geblieben sein muss, gilt: ( L) I ( 0) I ν ν e ( γ ( ν ) α ( ν )) L R Spiegel1 R Spiegel1 Da α, R Spiegel1 und R Spiegel konstant sind, ist diese Bedingung nu von γ abhängig und da de Lase ab dem, diese Gleichung efüllenden, Fakto γ zu abeiten beginnt, bezeichnet man diesen Wet mit γ th als Laseschwelle: 1 γ th ( ν ) = α( ν ) ln( RSpiegel1 RSpiegel1 ) L 1.11 Lase-Systeme, Helium-Neon-Gas-Lase Es gibt inzwischen viele unteschiedliche Lasesysteme. Nachdem Theodoe Maiman 1960 den esten Lase (einen Rubin-Festköpelase) gebaut hatte, folgten zunächst Gaslase (Stickstoff-, CO -Lase, He-Ne-Lase) und anschließend Fabstofflase, bei denen das laseaktive Medium flüssig ist. In de folgenden Zeit wude de spektale Nutzbeeich duch die Weiteentwicklung von Kistalltechnologien stak eweitet und so kamen duchstimmbae und beitbandige Lase (z.b. Titan-Saphi-Lase) auf den Makt. Neben den kontinuielichen (Dauestich ode englisch continious-wave) Lasen wuden Anfang de 80e Jahen Ultakuzpulslase (Impulsdauen von Pico- und Femtosekunden) und Ende de 80e Jahe Halbleite-Lasedioden ealisiet. In den 90e Jahen folgten Scheiben- und Faselase, die aufgund neue Pumpgeometien seh hohe Laseleistungen (bis 0kW) ezielen. Einsatz in de Medizin: In de Medizin kommen viele veschiedene Lasesysteme sowohl in de Diagnostik, als auch in de Theapie zum Einsatz. Die folgende Tabelle zeigt einige Lase mit ihen Einsatzbeeichen in de Medizin: Lase Lasetyp Anwendung in de Medizin Excime-Lase: Fabstofflase Honhautopeationen HL-Lase: Halbleitelase Honhautscanne, Bodyscanne Agon-Lase: Plasmalase Netzhautanheftung, Cytometie He-Ne-Lase: Gaslase Duchflusscytometie, Konfokalmikoskopie Titan-Saphi-Lase: Festköpelase unteschiedliche Opeationen Nd: YAG Festköpelase Opeationen am Auge Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 18

19 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Dabei emittieen die meisten Lase bei festen Wellenlängen gemäß de Laseübegänge des jeweiligen Mediums. Ein paa Beispiele sind im folgenden Bild zusammen mit de Kuve de Empfindlichkeit des menschlichen Auges (weiß) gezeigt: He-Ne-Lase Abb.: Wellenlängen unteschiedliche Lase und Laseübegänge [33] Eine de gängigsten Lase ist de Helium-Neon-Gas-Lase, welche aufgund de chemischen Symbole fü die Elemente Helium (He) und Neon (Ne) kuz nu He-Ne-Lase genannt wid. Auch in de Medizin wid e bei unteschiedlichen Methoden (wie späte gezeigt) angewendet. E lässt sich gut zu Veanschaulichung de oben ekläten theoetischen Gundlagen vewenden: Ein He-Ne-Lase ist gundsätzlich aus einem Glaszylinde aufgebaut, in dessen Inneen sich unte vemindetem Duck das He-Ne-Gasgemisch befindet. In ihm findet auch die elektische Entladung statt. An beiden Enden hat de Zylinde um den Bewste-Winkel gegen die Zylindeachse gekippte Fenste. Somit kann dot nu Stahlung eine bestimmten Polaisationsichtung eflexionsfei austeten. Außehalb des Zylindes liegen senkecht zu Zylindeachse zwei Spiegel, zwischen denen die Stahlung so in sich eflektiet wid, dass sie den Zylinde vielfach duchläuft und bei jedem Duchgang Lasestahlung induziet bzw. duch diese kohäent vestäkt wid. Die Wellenlänge de sich hiebei ausbildenden stehenden Welle hängt vom Abstand de Spiegel ab. De Zylinde mit den Spiegeln stellt also einen Resonato da, de die Vestäkung und Emission in einem nu seh schmalen Fequenzintevall ( ν 1Hz) bewikt. Eine de beiden Spiegel ist zu einem seh geingen Teil duchlässig, woduch die Lase-Stahlung kohäent und extem monochomatisch in den Außenaum gelangt. Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 19

20 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Abb.: Typische Aufbau eines He-Ne-Lases [8] Beim He-Ne-Lase wid die Pumpenegie in de Gasentladung duch Elektonenstoß hauptsächlich den He-Atomen zugefüht, welche so vom Gundzustand in zwei metastabile Zustände mit goße Lebensdaue anhoben weden. Duch Stöße (sog. Stöße zweite At) wid die Anegungsenegie de He-Atome auf die Ne-Atome übetagen, wobei fü die Ne-Atome eine Besetzungsinvesion bestimmte Anegungsniveaus (Laseniveaus) gegenübe tiefe liegenden Enegiezuständen (wie dem Gundzustand) ezeugt wid. Die Ne-Atome emittieen dann Lasestahlung im oten und infaoten Beeich des Spektums (63,8; 115 und 3391nm). Abb.: Enegieschema eines He-Ne-Lases [8] Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 0

21 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik 3. Lase induziete Fluoeszenz In vielen Fällen lässt sich mit de Betachtung eine Substanz ode eines Gewebes unte weißem Licht nicht ekennen, um was fü eine At Substanz ode Gewebe es sich handelt. In einigen Fällen hilft hie die Eigenschaft de Fluoeszenz manche Moleküle, um diese ode Beeiche, an die sie gekoppelt sind, zu identifizieen. Bei de laseinduzieten Fluoeszenz egt ein Lasestahl die Moleküle in einen angeegten Zustand an. Andes als beim Lase selbe senden die Moleküle bei de Abegung nicht wiede Licht de gleichen Wellenlänge aus, sonden etwas langwelligees als das des Lases. 3.1 Physikalische Gundlagen Enegieniveaus bei Molekülen Ähnlich wie bei Atomen gibt es auch bei Molekülen nu diskete Zustände (Enegien) in denen sich das Molekül befinden kann. Diese sind jedoch komplexe, da zusätzlich zu den elektonischen Niveaus (wie beim Atom) noch vibatoisch und otatoische Niveaus hinzukommen. Die Enegieabstände zwischen elektonischen Zuständen sind am gößten und liegen bei einigen ev, die zugehöige Stahlung liegt somit im sichtbaen Beeich. Die Stahlung von Schwingungsübegängen liegt mit etwa 3 bis 10µm im mittleen Infaot. Die Enegiediffeenzen sind bei Rotationsübegängen am geingsten. Die entspechenden Wellenlängen sind mit ca. 30 bis 150 µm im fenen Infaot zu finden. Elektonische Niveaus Wie beim Atom besitzen Moleküle elektonische Niveaus, zwischen denen die Elektonen duch Übegänge unte bestimmten Voaussetzungen wechseln können. Die Enegie eines elektonischen Zustandes wid mit E el.(i) bezeichnet: E = E el () i Vibatoische Niveaus Ein Molekül kann im Gegensatz zum Atom auch zu Schwingungen angeegt weden. Dabei schwingen die Atome des Moleküls auf unteschiedliche At und Weisen, je nach At des Moleküls um den Gleichgewichtsabstand 0. Ein Hantelfömiges Molekül aus zwei Atomen stellt damit in este Näheung einen hamonischen Oszillato da. Die quantenmechanische Enegie eines solchen ist: E E vib 1 = h ω v + Hiebei ist v die Vibationsquantenzahl mit v = 0, 1,, Abb.: hamonische Oszillato [] Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 1

22 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Reale Moleküle weichen abe z. T. stak von diesem Vehalten ab. Da sich die Atome aufgund de imme stäke wedenden abstoßenden Coulombwechselwikung nicht beliebig nah kommen können, steigt das eale Potential fü 0 zwa ebenso wie das Potential des hamonischen Oszillatos steil an und geht gegen Unendlich, jedoch veliet auch die anziehende Wechselwikung ihe Wikung, wenn die Atome sich zu weit von einande entfenen. Das vibatoische Potential wid dahe viel besse duch das sog. Mosepotential beschieben: E a( 0 ) E = E + E 1 e Abb.: Mosepotential mit disketen Enegieniveaus [] Rotatoische Niveaus Mose 0 Dissoziation ( ) E 0 ist die Nullpunktsenegie des Potentials, E Dissoziation die Dissoziationsenegie, 0 de Gleichgewichtsabstand und a ein Paamete. Mit Hilfe de Schödingegleichung egeben sich die Enegieniveaus dann zu: E 1 h ω 1 vib = h ω v + v + + 4EDissoziation Fü jeden einzelnen elektonischen Zustand gibt es eine solche vibatoische Potentialkuve mit den entspechenden vibatoischen Enegieniveaus. Diese weden wiedeum von meheen otatoischen Niveaus, die deutlich enge beieinande liegen, übelaget. ˆ J Die Rotationsenegie ist gegeben duch: E ot = I Hiebei ist I das Tägheitsmoment I = µ R mit de eduzieten Masse µ. De Dehimpuls ist gequantelt. Die Eigenwete von J sind: ( ) J ist die Dehimpulsquantenzahl: Die quantenmechanisch Rotationsenegie eines Moleküls ist damit: J ( J + 1) h Eot = EJ = I J = 0, 1,, 3, 3 ( ) O v J ˆ J J + 1 h Abb.: Enegieniveaus bei Molekülen Den zwei elektonischen Enegieniveaus sind die Vibationsniveaus und denen die Rotationsniveaus übelaget [7] Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite:

23 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Die Tanslationsenegie ist nicht gequantelt und wid dahe im Temschema nicht dagestellt. Wähend eines Übegangs kann sie als konstant angenommen weden. Gesamtenegie Die Gesamtenegie setzt sich nun aus allen dei Teilenegien zusammen: E Ges 1 h ω = Eel() i + Evib + Eot = Eel() i + hω v + 4E Dissoziation 1 v + + J ( J + 1) I h 3.1. Optische Übegänge Das Laselicht uft eine induziete Absoption seine elektomagnetischen Stahlung hevo, woduch die Moleküle von einem niedigeen in ein höhees Enegieniveau übegehen. Duch stahlungslose Übegänge in ein tiefe gelegenees Niveau velieen sie einen Teil de gewonnen Enegie wiede. Anschließend efolgt ein optische Übegang in das höchstliegende Niveau des elektonischen Gundzustandes, nicht abe in den Gundzustand selbe. Bei diesem Übegang gibt das Molekül einen Goßteil seine Enegie in Fom von elektomagnetische Stahlung wiede ab. Diese elektomagnetische Stahlung ist das Fluoeszenzlicht. Welche Übegänge geschehen besagen u. a. die vom Atom he bekannten Auswahlegeln. Bei Molekülen gilt: v = ±1 D.h. es finden nu Übegänge zwischen benachbaten Schwingungsniveaus statt. Dieses gilt steng genommen nu fü den hamonischen Oszillato, bei dem anhamonischen Potential sind mit abnehmende Wahscheinlichkeit auch v = ±, ±3, elaubt. S = 0 Ebenso wie beim Atom daf de Spin bei einem optischen Übegang nicht umklappen. J = ±1 De Dehimpuls daf sich ebenfalls nu um + ode -1 änden. Somit ist das Spektum eines Moleküls viel linieneiche als das eines Atoms, da zu eine Ändeung des elektonischen Zustand ein sog. Bandensystem gehöt. Jede einzelnen Bande entspicht einem gleichzeitigen Schwingungsübegang beim elektonischen Übegang, und besteht wiedeum aus einzelnen Spektallinien, zu denen jeweils ein paallel zum elektonischen Übegang und zum Schwingungsübegang stattfindende Rotationsübegang gehöt Fanck-Condon-Pinzip Die Übegänge weden zudem duch das Fanck-Condon- Pinzip beschieben. Dieses besagt, dass ein Übegang so schnell geschieht, dass das Molekül seine momentanen Atomabstände dabei nicht änden kann. Im E()-Diagamm sind die Übegänge dahe stets senkecht. Mit andeen Woten bedeutet das, dass die wahscheinlichsten Übegänge bei Kenabständen efolgen, bei denen die Aufenthaltswahscheinlichkeit in den Schwingungszuständen am gößten ist. Abb.: Fanck-Condon-Pinzip [30] Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 3

24 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Fluoeszenz Bei de sog. Fluoeszenz wid ein Molekül im Gundzustand duch einfallende Stahlung in einen enegetisch höheen Zustand vesetzt. Ein solches angeegtes Molekül kann auf veschiedene Aten die Enegie wiede abgeben. Fluoeszieende Moleküle tun dieses auf eine ganz bestimmte At und Weise: Abb.: Fluoeszenzschema im E()- Diagamm [6] Zunächst wid ein Teil de gewonnen Enegie innehalb eines elektonischen Niveaus duch stahlungslose Übegänge in den vibatioischen Gundzustand wiede abgegeben. Anschließend folgt de stahlende Übegang, bei welchem das Molekül einen Goßteil de Enegie wiede in Fom von Stahlung abgibt. Diese ist jedoch nicht so enegieeich wie die anegende Stahlung und somit langwellige, da zum Einen schon ein Teil de Enegie duch die stahlungslosen Übegänge abgegeben wude und zum Andeen de stahlende Übegang nicht in den Gundzustand zuückfüht. Nach de Stahlungsabgabe befindet sich das Molekül imme noch in einem angeegten, abe schon im elektonischen Gundzustand. Die weitee Abegung efolgt wiede stahlungsfei, bis sich das Molekül wiede im Gundzustand befindet. Da die Wellenlänge de emittieten Fluoeszenzstahlung fü jedes Molekül chaakteistisch ist, lassen sich anhand ihe Moleküle voneinande untescheiden. Die stahlungslose Enegieabgabe kann bei einem Molekül auf mehee Aten geschehen: - Duch Stöße kann Enegie an die Umgebung abgegeben weden, wähend das Molekül im gleichen elektonischen Zustand vebleibt. - Auch stahlungslose Übegänge zwischen elektonischen Enegieniveaus sind möglich. Sie efolgen seh schnell in 10-1 s. Diese Pozess wid mit intenal convesion bezeichnet. - Eine ditte Möglichkeit ist das sog. intesystem cossing, bei dem ein Molekül von einem Singulett- in einen Tiplettzustand wechselt, was natülich mit eine Umkeh des Spins vebunden ist. Dieses ist optisch veboten und geschieht auch nu mit eine seh geingen Übegangswahscheinlichkeit. Die beiden zuletzt genannten Pozesse finden bei de Fluoeszenz nicht statt. In den folgenden Bilden sind die Absoptions- und Emissionsbanden (mit entspechendem Wellenlängenmaximum) von dei Fluoeszenzmaken sowie die Wellenlängen de anegenden Lasestahlung gezeigt: Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 4

25 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Abb.: Fluoeszenzabsoptions- und Emissionspofil deie handelsübliche Fluoeszenzmolekülen mit jeweiligem Wellenlängenmaximum und den Wellenlängen de induzieenden Lase (jeweils oben im Bild) in nm [5] DAPI: Diamidino--Phenylindoldihydochloid FITC: Fluoeszein Isothiocyanat TRITC: Tetamethylhodamin Isothiocyanat Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 5

26 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik 3. Methode Die medizinisch genutzte laseinduziete Fluoeszenz nutzt die Tatsache, dass goße Biomoleküle z. T. selbst fluoeszieen ode zumindest eine fluoeszieende, chemische Guppe duch eine chemische Reaktion angehängt weden kann. Daduch lassen sich die entspechenden Moleküle leicht mittels Fluoeszenz identifizieen. Wie späte unte 3.3 in den Anwendungen zu sehen ist dieses Vefahen seh vielfältig. Da sich die Methoden im Goßen und Ganzen abe ähneln wid hie exemplaisch nu die Duchflusscytometie eläutet. Duchflusscytometie (Flow Cytomety / FACS): Die Duchflusscytometie wid in de Liteatu z.t. auch mit FACS (Fluoescent Activated Cell Soting) bezeichnet, was ein egistietes Makenzeichen de Fima Becton-Dickinson ist, und wie Tempo anstelle von Taschentuch genutzt wid. De englische Name Flow Cytomety bezeichnet die elativ junge Labotechnik de Untescheidung unteschiedliche Teilchen ode Zellen mit Hilfe de Fluoeszenz. Hiebei weden die unteschiedlichen Eigenschaften de Teilchen / Zellen untesucht, wähend sie langsam hinteeinande duch eine dünne, meist gläsene Messkamme, die sog. Flusszelle (engl.: Flow Cell ) fließen. In diese Messkamme weden die Teilchen / Zellen seitlich von einem Lasestahl zu Fluoeszenz angeegt. Das emittiete Licht wid anschießend analysiet und die Zellen / Teilchen gegebenenfalls duch Coulomb- Wechselwikung sotiet. Abb.: Pinzipskizze eines Flow Cytometes mit anschließende Sotieung (echts) [5] und handelsübliche dichoitische Fluoeszenzfilte (unten) [9] Die Geäte zu Estellung duchflusscytometische Analysen heißen gemäß de Methode Duchflusscytomete (engl.: Flow Cytomete) ode wie oben beschieben FACS-Geäte bzw. kuz FACS. Abb. (links): Duchflusscytomete de Fima Beckman-Coulte mit Compute zu Datenauswetung [3] Abb. (echts): Becton Dickinson FACSAia Soting Flow Cytomete [7] Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 6

27 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Am Anfang eine jeden Messung gelangt die eigentliche Pobe duch die Pobennadelspitze in eine schnelle als die Pobe selbst fließende Hüll-Flüssigkeit. Die daduch efolgende Beschleunigung bewikt, dass die Patikel einzeln, nacheinande in Fokus des Lasestahls gelangen. Die esultieende Stahlgeschwindigkeit liegt bei etwa 1-10m/s. So gelangen Teilchen po Sekunde in den Stahl. Abb. (links): Übefühung de Pobe in einzelne Patikel duch Beschleunigung mittels Hüllflüssigkeit [4] Abb. (echts): Messkamme eines Duchflusscytometes [3] Die Teilchen / Zellen kommen von oben (gaue Pfeil) und fließen hinteeinande duch die eigentliche Flusszelle (die Stecke innehalb de Flusszelle ist duch einen gauen Stich gekennzeichnet). Dabei weden die Zellen von einem Lase von de Seite bestahlt (blau eingezeichnet). Die Göße de Kamme betägt etwa 4 cm x 7 cm. Im Lasestahl geschehen zwei Pozesse, welche die Identifizieung de Teilchen emöglichen. Das ist zum Einen die Steuung, welche in Vowäts- und in Seitwätssteuung unteteilt wid, und zum Andeen die Fluoeszenz. 1.) Steulicht Ein Teilchen, das in den Lasestahl gelangt, veusacht eine Steuung des Laselichtes. Dabei wid umso meh Licht gesteut, umso göße das Teilchen ist, und umso meh Stuktuen sich in dessen Inneen befinden. Dabei wid das Licht in unteschiedliche Richtungen gesteut. Dahe wid das Steulicht in de Regel an zwei Stellen gemessen: Abb.: Steulichtdetektion [3] Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 7

28 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik a) Vowätssteulicht (fast in Richtung des uspünglichen Stahls) (engl.: Fowad Light Scatte ode Low Angle Scatte) Das Vowätssteulicht ist pimä von de Göße de Teilchen abhängig; kleine Teilchen veusachen ein kleines, goße Teilchen ein goßes Vowätssteulichtsignal. Abb.: Vowätzssteulichtdetektion [3] b) Seitwätssteulicht (etwa im echten Winkel zum uspünglichen Stahl) (engl.: Side Scatte, Othogonal Scatte ode Right Angle Scatte) Auch das Seitwätssteulicht hängt stak von de Göße de Teilchen ab. Zusätzlich ist es abe auch seh stak von dem Inhalt eine Zelle abhängig. So steut eine Zelle, in de sich seh viele Lysosomen befinden, das Licht deutlich stäke seitwäts, als eine Zelle mit nu seh wenigen Lysosomen. Da nach Anfäbung de weißen Blutköpechen die Lysosomen unte einem Lichtmikoskop als könige Stuktuen sichtba weden, spicht man bei Lysosomeneichen Zellen auch von königen Zellen. Diese Köne in de Zelle nennt man Ganula und die Königkeit eine Zelle Ganulaität. Könige Zellen (Zellen mit hohe Ganulaität / vielen Könen) zeigen im Duchflusscytomete also eine stake, wenige könige Zellen eine schwache Seitwätssteuung. Dieses lässt sich am Beispiel weiße Blutköpechen vedeutlichen: Lymphozyt Monozyt Neutophile Ganulozyt klein, kaum Ganula goß, kaum Ganula goß, Ganula Abb.: Weiße Blutköpechen: Lymphozyt, Monozyt und Neutophile Ganulozyt [3] Lysosomen: kleine, Enzymspeichende Bläschen Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 8

29 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik Abb.: Seitwätssteulichtdetektion [3] Die Steulicht-Messegebnisse weden de Anschaulichkeit halbe in eine sog. Dot-Plot Gaphik dagestellt. Hiezu tägt man auf de x-achse die Intensität des Vowäts- und auf de y- Achse des Seitwätssteulicht auf. So lassen sich anhand von Anhäufungen Zellen, die ähnliche Steulichteigenschaften haben, ekennen. Am echts stehenden Beispiel Steulicht-Dot- Plot ekennt man deutlich Ansammlungen gleiche ode ähnliche Zellen. Dabei entspicht die güne Ansammlung: Lymphozyten (klein, kaum Ganula) wenig FSC, wenig SSC blaue Ansammlung: Monozyten (goß, kaum Ganula) viel FSC, wenig SSC ote Ansammlung: Neutophilen Ganulozyten (goß, viel Ganula) viel FSC, viel SSC Ein eale Steulicht-Dot-Plot sieht dabei nicht wie de oben stehende, sonden wie in de Abbildung links gezeigt, aus. Jede Punkt entspicht einem gemessenen Eeignis, also in de Regel eine Zelle. Die Faben weden den Punkten est bei de Auswetung zugeodnet und haben nichts mit de Fabe des Steu- ode Fluoeszenzlichtes zu tun. Abb.: eale Steulicht-Dot-Plot (links) und anschauliche Steulicht-Dot-Plot (Punkte entspechen Teilchen) (oben) [3] Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 9

30 Lasevefahen in de medizinischen Diagnostik.) Fluoeszenzlicht Zusätzlich zu Steulichtanalyse, mit de man wie gezeigt weiße Blutköpechen untescheiden kann, kommt nun noch die Fluoeszenzlichtanalyse, die eine Untesuchung eine Vielzahl von Mekmalen auf den Blutzellen elaubt. Hiezu ist folgendes nötig: Um eine Zelle mittels Fluoeszenz auf ein bestimmtes Mekmal hin zu untesuchen, muss diese Zelle (und zwa nu diese Zelle) fluoeszieen. Da die Zellen in de Regel von allein nicht fluoeszent sind, muss de Zelle eine fluoeszieende Guppe angehängt weden. Damit sich die fluoeszieende Guppe nicht an alle Aten von Zellen anhängt, geschieht dieses mit einem Antiköpe, de genau gegen das Mekmal geichtet ist, auf welches die Zelle hin untesucht weden soll. Die fluoeszieende Guppe wude dabei zuvo dem Antiköpe angehängt. Man nennt diesen Vogang das Makieen eine Zelle. Wie die Antiköpe mit de fluoeszieenden Guppe vesehen weden ist nicht Gegenstand dieses Votags. Es sei hie nu ewähnt, dass solche makieten Antiköpe, die sich gegen eine goße Zahl von Zellmekmalen ichten, bei veschiedenen Fimen käuflich zu eweben sind. Da jeweils nu Antiköpe, die gegen ein bestimmtes Mekmal vogehen, eingesetzt weden, sind auch nu die entspechenden Zellen makiet und weden duch die Fluoeszenz beim Duchqueen des Lasestahls sichtba. Eine mögliche, gün fluoeszieende Guppe ist das sog. FITC (Fluoeszein-Isothiocyanat), eine andee, oange-faben fluoeszieende Guppe ist das sog. PE (Phycoythin). Abb.: Handelsübliche Antiköpe, die mit eine fluoeszieenden Guppe vesehen wuden [3] links: CD3 Antiköpe (gegen T-Lymphozyten), vesehen mit FITC (Fluoeszein-Isothiocyanat) echts: CD19 Antiköpe (gegen B-Lymphozyten), vesehen mit PE (Phycoythin) Das Makieen de Zellen geschieht vo de Messung in einem Reagenzglas und benötigt eine gewisse Zeit, die sog. Inkubationszeit. Anschließend wid die vobeeitete Pobe in das Duchflusscytomete gegeben und wie oben beschieben zestäubt und gelangt so stak zekleinet in den Lasestahl. Duchquet eine Zelle, die mit dem FITC-Antiköpe makiet ist, den Lasestahl, so leuchtet sie gün auf. Eine oange-faben aufleuchtende Zelle ist dann eine mit einem PE-Aniköpe makiete Zelle. Abb.: Fluoeszenzlichtdetektion [3] Hauptsemina Expeimentalphysik SS 006 Seite: 30