Anhang B zur Richtlinie der GTFCh zur Qualitätssicherung bei forensisch-toxikologischen Untersuchungen

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1 Geellchaft fü Toxikologiche und Foeniche Chemie Abeitkei Qualitäticheung Anhang B zu Richtlinie de GTFCh zu Qualitäticheung bei foenich-toxikologichen Unteuchungen Anfodeungen an die Validieung von Analyenmethoden Autoen: F. T. Pete, Jena; M. Hatung, Hombug/Saa; M. Hebold u. G. Schmitt, Heidelbeg; T. Daldup, Düeldof; F. Mußhoff, Bonn Übeabeitung duch F. T. Pete, Jena und L. D. Paul, München unte Mitabeit de übigen Mitgliede de Unteguppe Richtlinien de AK Qualitäticheung: F. Mußhoff, Bonn; B. Aebi, Ben; V. Auwäte, Feibug; T. Kaeme, Hombug; G. Skopp, Heidelbeg Mitgliede de AK Qualitäticheung Seite 1 von 4 Veion 01 Ändeunghinweie: Datum Seite Keine ete übeabeitete Faung Inhaltvezeichni 1 Einfühung... 3 Beweiende, identifizieende bzw. Betätigungvefahen Selektivität (Selectivity) Lineaität de Kalibation (Lineaity of Calibation), nach Ref. [8] Kalibationbeeich (Range), nach [1] Genauigkeit (Accuacy), nach Ref. [1] Sytematiche Fehle (Bia) und Richtigkeit, nach [1] Päziion (Peciion), nach [1] Wiedeholpäziion (Repeatability), nach Ref. [10] Labopäziion Vegleichpäziion (Repoducibility), nach Ref. [10] Gemeiname Akzeptanzintevall fü Bia und Päziion Stabilität (Stability), nach Ref. [0] Stabilität aufgeabeitete Poben (Poceed ample tability) Einfie-/Auftautabilität (Feeze/thaw tability) Langzeittabilität (Long-tem tability) Analytiche Genzen Nachweigenze (Limit of Detection, LOD) Betimmunggenze (Limit of Quantification, LOQ) Wiedefindungate, Extaktionaubeute Wiedefindungate (Recovey), fei nach [1] Extaktionaubeute (Extaction efficieny) Matixeffekte und Wiedefindung bei LC-MS(/MS)-Methoden Robutheit (Robutne, Ruggedne), fei nach Ref. [0] Immunchemiche Methoden Selektivität... 17

2 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite von 4 3. Aueichende Empfindlichkeit Liteatu Inkaftteten... 0 Anhang I: Beechnung de Päziiondaten... 1 Anhang II: Beechnung de 95% β-toleanzintevall gemäß [5]... 4

3 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 3 von 4 1 Einfühung Die Validieung analytiche Methoden it eine Gundvoauetzung fü die Qualität und die Vegleichbakeit von Analyenegebnien. Sie dient de Dokumentation de Eignung von Analyenvefahen fü ihen Betimmungzweck. Analyenbefunde, die mit validieten Methoden ehoben weden, ind dahe nicht nu die Bai fü eine veläliche Intepetation, onden auch im Steitfall nu chwe anfechtba. Die pielt auch im foenich-toxikologichen Beeich eine goße Rolle. Gemäß Kapitel 1 de "Richtlinie de GTFCh zu Qualitäticheung bei foenich-toxikologichen Unteuchungen" müen Laboatoien Gewäh dafü bieten, da Analyen nach dem aktuellen und anekannten Stand de Analyentechnik augefüht weden. Im elben Dokument wid unte Kapitel 5 die Validieung analytiche Methoden und die Dokumentation de Egebnie de Validieung vogechieben. Die impliziet, da auch die Validieung analytiche Methoden ich an dem aktuellen und anekannten Stand de Wienchaft oientieen ollte. Im voliegenden Anhang B de Richtlinie weden die Anfodeungen an die Validieung egelmäßig in de Routine angewendete Methoden nähe pezifiziet. Die enthaltenen Vogaben oientieen ich am aktuellen wienchaftlichen Kenntnitand. Neben den zu betimmenden Validieungpaameten und ihen jeweiligen Akzeptanzkiteien weden auch tatitiche Vefahen zu Beechnung de einzelnen Paamete fetgelegt. Fü Methoden, die nu fü einen einzigen Fall ode eh elten zu Anwendung kommen, und Methoden zu Analye von Potmotem-Mateial kann gemäß Ref. [1] de Validieungaufwand u.u. eduziet bzw. auf die Standadadditionmethode zuückgegiffen weden. Wid eine beeit validiete Methode modifiziet, o it zu zeigen, da die modifiziete Methode fü den Betimmungzweck geeignet it. Die kann im Rahmen eine Teilvalidieung efolgen, in de möglicheweie von de Modifikation betoffene Validieungpaamete in augewählten Validieungexpeimenten eneut unteucht weden.

4 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 4 von 4 Beweiende, identifizieende bzw. Betätigungvefahen.1 Selektivität (Selectivity) Selektivität it die Fähigkeit eine Methode, vechiedene nebeneinande zu betimmende Analyten ohne gegeneitige Stöungen ode Stöungen duch andee endogene ode exogene Subtanzen (Metaboliten, Veuneinigungen, Abbaupodukte, Matix) zu efaen und ie omit eindeutig zu identifizieen. Spezifität it die Fähigkeit eine Methode, einen Analyten ode eine Subtanzklae ohne Vefälchung duch andee in de Pobe vohandene Komponenten (.o.) zu efaen und ie omit eindeutig zu identifizieen. Betimmung in de Paxi: - Aufabeitung von mindeten ech Leepoben au jeweil vechiedenen Chagen (Leematix ohne Intenen Standad (IS), Blank-Pobe) - Aufabeitung von mindeten zwei Nullpoben (Leematix mit IS, Zeo-Pobe) - Aufabeitung aufgetockte Leepoben mit andeen in authentichen Poben zu ewatenden Subtanzen/Metaboliten - ggf. zuätzlich Aufabeitung authentiche Poben, die hohe Konzentationen potentiell intefeieende Subtanzen mitamt ihe chaakteitichen Metabolitenpektum enthalten Bei keinem de oben genannten Veuche düfen Intefeenzen (z.b. töende Peak) mit dem Unteuchungziel (Nachwei und/ode Betimmung de/de Analyten) aufteten. Weden in analytich begündeten Aunahmefällen nu zwei diagnotiche Ionen zu Identifizieung bei Einzelionendetektion vewendet, ehöht ich die Anzahl de zu analyieenden Leepoben au jeweil vechiedenen Chagen auf mindeten 0. In den Auftockveuchen it entpechend ein weitee Spektum von Subtanzen/Metaboliten auf mögliche Intefeenz zu teten. Hinwei: Bei ein quantitativen Methoden kann, wenn die Richtigkeit beeit bewieen wude, auf eine geondete Aufabeitung von Lee- und Nullpoben vezichtet weden.

5 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 5 von 4. Lineaität de Kalibation (Lineaity of Calibation), nach Ref. [8] Die Lineaität eine analytichen Methode it ihe Fähigkeit, innehalb eine gegebenen Beeiche Tetegebnie zu liefen, die diekt popotional zu Konzentation (Menge) de Analyten in de Pobe ind...1 Kalibationbeeich (Range), nach [1] De Kalibationbeeich eine analytichen Methode it da Intevall zwichen obee und untee Konzentation (Menge) de Analyten in de Pobe (einchließlich diee Konzentationen), fü da ein geeignete Maß an Päziion, Richtigkeit und Lineaität gezeigt weden konnte. E ollte o gewählt weden, da e einen möglicht goßen Anteil de in authentichen Poben zu ewatenden Konzentationen abdeckt. Sofen bekannt, ollte de theapeutiche Konzentationbeeich möglicht innehalb de Kalibationbeeich liegen. Betimmung in de Paxi: - Hetellung von Kalibatoen bei mindeten fünf von Null vechiedenen Konzentationen (möglicht gleichmäßig übe den Kalibationbeeich veteilt) duch Auftocken von Leematix, wobei de niedigte (nicht Null) Kalibato göße ode gleich de Betimmunggenze ein mu - ech Betimmungen bei jede Konzentation (Wiedeholbedingungen) - Auftagen de Peakflächenvehältnie, ggf. auch Peakhöhenvehältnie, (Analyt/IS) gegen die Sollkonzentationen de Kalibatoen - Teten auf Aueie mittel Gubb-Tet (Signifikanzniveau: 95%) und ggf. deen Elimination. Ingeamt düfen nicht meh al zwei Aueie und diee nicht auf dem gleichen Konzentationniveau aufteten. - Tet auf Vaianzhomogenität mittel F-Tet zwichen höchte und niedigte Konzentation ode mittel Cochan-Tet übe alle Konzentationen (Signifikanz: 99%). - Vaianzhomogenität gegeben (Homokedatizität): einfache lineae Regeion; tatitiche Tet de Anpaung mittel Lineaitättet nach Mandel (Signifikanz: 99%) - Vaianzhomogenität nicht gegeben (Heteokedatizität); Regelfall fü Kalibationbeeiche, die meh al eine Zehnepotenz umfaen: Altenative I: Altenative II: Einchänkung de Kalibationbeeich bi Vaianzhomogenität beteht. Auwahl und tatitiche Anpaungtet eine gewichteten Kalibationmodell. In de Regel kann mit den Wichtungfaktoen 1/x ode 1/x eine aueichende Kompenation de Heteokedatizität eeicht weden.

6 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 6 von 4 Vo de Ablehnung eine lineaen Kalibationmodell ollte die paktiche Relevanz de Nichtlineaität z.b. an Hand de Richtigkeitdaten bewetet weden; ind diee akzeptabel, kann man totzdem da lineae Modell vewenden. Anmekung: Sollen in de Routineanwendung Reinubtanzlöungen al Kalibatoen eingeetzt weden, o it in de Validieung zu zeigen, da die Kalibationgeaden von Matixkalibatoen und Reinubtanzkalibatoen ich nicht ignifikant untecheiden: - Vaianzhomogenität de Retvaianzen de beiden Kalibationgeaden mittel F-Tet (Signifikanz: 99%) - Regeionanalye de Mittelwete de Megößen von Matix- und Reinubtanzkalibation: Sollwet-t-Tet (Signifikanz: 99%) fü den Achenabchnitt (Sollwet: 0) und die Steigung (Sollwet: 1) de Regeiongeaden..3 Genauigkeit (Accuacy), nach Ref. [1] Unte Genauigkeit veteht man den Abtand eine einzelnen Wete vom Sollwet, hevogeufen duch ytematiche und zufällige Fehle. Betimmung in de Paxi: - Hetellung homogene Pool von Qualitätkontollpoben (QC-Poben) bei mindeten zwei (niedig und hoch elativ zum Kalibationbeeich), möglicht abe dei vechiedenen Konzentationen (niedig, mittel, hoch elativ zum Kalibationbeeich) duch Auftockung von Leematixpool - Aliquotieung zu einzelnen QC-Poben - Lageung bei nomalen Lageungbedingungen (z.b. 0 C) - Analye von mindeten zwei QC-Poben jede Konzentation an mindeten acht vechiedenen Tagen E wid empfohlen, einen zuätzlichen QC-Pool mit Konzentationen deutlich obehalb de Kalibationbeeiche anzuetzen. Diee QC-Poben weden unte Vewendung entpechend geingee Pobenvolumina ode nach entpechende Vedünnung aufgeabeitet, o da die Analytkonzentationen in de aufgeabeiteten Pobe innehalb de Kalibationbeeiche liegen. Die fü diee QC-Poben ehaltenen Egebnie weden mit entpechenden Koektufaktoen multipliziet und analog den übigen QC-Daten zu Betimmung von Richtigkeit und Päziion heangezogen.

7 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 7 von Sytematiche Fehle (Bia) und Richtigkeit, nach [1] Unte Bia veteht man die Diffeenz zwichen Meegebni und Sollwet. E it ein Maß fü die ytematiche Fehlekomponente eine quantitativen Analyenvefahen. - De Bia eechnet ich au dem Mittelwet alle Betimmungen und dem Sollwet bei jede Konzentation nach folgende Fomel: Bia µ µ [%] = 100% Mittelwet alle Betimmungen µ Sollwet - Bia-Wete innehalb eine Intevall von ±15% (±0% nahe de Betimmunggenze) gelten al akzeptabel Unte Richtigkeit (Tuene) veteht man den Abtand de Mittelwete eine aueichend goßen Anzahl von Meweten (z.b. Kontollwete au de Routineanwendung) vom Sollwet. Da Aumaß an Richtigkeit wid gewöhnlich in Fom eine ytematichen Fehle (Bia) augedückt..3. Päziion (Peciion), nach [1] Unte Päziion veteht man den Gad de Steuung de einzelnen Wete um den Mittelwet. Sie it ein Maß fü die zufällige Fehlekomponente eine quantitativen Analyenvefahen. Die Päziion wid gewöhnlich in Fom de Impäziion augedückt und al eine Standadabweichung de Meegebnie beechnet. Höhee Impäziion wid duch eine höhee Standadabweichung augedückt Wiedeholpäziion (Repeatability), nach Ref. [10] Päziion unte Bedingungen, bei denen unabhängige Meegebnie mittel deelben Methode mit identichem Pobenmateial im elben Labo von deelben Peon mit deelben Geätchaft innehalb kuze Zeitintevalle ehalten weden.

8 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 8 von 4 Beechnung: Bei obige Veuchanodnung kann die Beechnung unte Zuhilfenahme de in Anhang I zu diee Richtlinie aufgefühten Fomeln wie folgt efolgen: - Betimmung al elative Standadabweichung (Vaiationkoeffizient) innehalb de Tage RSD RSD [%] = 100 Wiedeholpäziion Wiedeholvaianz, zu beechnen nach Anhang I Mittelwet alle Betimmungen - RSD 15% (0% nahe de Betimmunggenze) gelten al akzeptabel.3.. Labopäziion Päziion bei de Betimmung deelben Pobe innehalb eine Labo bei bewute Ändeung eine Paamete (z.b. Peon, Geätchaft ode Zeit) Tagevechiedene Labopäziion (time-diffeent intemediate peciion) Die tagevechiedene Labopäziion, bei de de Zeitfakto Tag zwichen den Betimmungen vaiiet, it die gängigte Vaiante de Labopäziion. Beechnung: Bei obige Veuchanodnung kann die Beechnung de tagevechiedenen Labopäziion unte Zuhilfenahme de in Anhang I zu diee Richtlinie aufgefühten Fomeln wie folgt efolgen: - Betimmung al elative Standadabweichung RSD (T) RSD (T) t t + % = tagevechiedene Labopäziion [ ] 100 Wiedeholvaianz, beechnet nach Anhang I Vaianz zwichen den Tagen, beechnet nach Anhang I Mittelwet alle Betimmungen - RSD (T) 15% (0% nahe de Betimmunggenze) gelten al akzeptabel Analoge Veuchanodnungen zu Betimmung von peonen- bzw. equipmentvechiedene Labopäziion ind möglich.

9 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 9 von Vegleichpäziion (Repoducibility), nach Ref. [10] Päziion unte Bedingungen, bei denen Meegebnie mit deelben Methode mit identichem Pobenmateial in vechiedenen Laboatoien von vechiedenen Peonen mit vechiedenem Equipment ehalten weden. Die Vegleichpäziion wid auch häufig Repoduziebakeit genannt. Beechnung: Die Vegleichpäziion kann au de obigen Veuchanodnung nicht beechnet weden. Ihe Betimmung kann z.b. duch Analye von QC-Poben in vechiedenen Labo (z.b. in einem Ringveuch, bei dem alle Teilnehme dieelbe Analyenvochift benutzen) efolgen..3.3 Gemeiname Akzeptanzintevall fü Bia und Päziion Zuätzlich zu den oben genannten epaaten Akzeptanzkiteien fü Bia und Päziion ollte die Genauigkeit (Kombination Bia und Päziion), augedückt al o genannte 95% β- Toleanzintevall, volltändig innehalb eine Akzeptanzintevall von ±30% liegen (±40% nahe de Betimmunggenze). Wuden de Bia und die tagevechiedene Labopäziion mit Doppelbetimmungen an acht vechiedenen Tagen betimmt, o kann eine Abchätzung de entpechenden β-toleanzintevall mittel folgende Näheunggleichungen efolgen: L L u o [%] = Bia[ %],508 RSD [%] [%] = Bia[ %] +,508 RSD [%] (T) (T) L u L o untee Genze de 95% β-toleanzintevall obee Genze de 95% β-toleanzintevall Die mit dieen Näheunggleichungen emittelten Genzen de Toleanzintevall tellen den ungüntigten Fall da. Liegen ie dennoch innehalb de Akzeptanzintevall, ind die Kiteien omit efüllt. Liegen ie außehalb de Akzeptanzintevall, it mittel de in Anhang II gegebenen Gleichung fü die genaue Beechnung de jeweiligen 95% β-toleanzintevall zu übepüfen, ob die Methode die Akzeptanzkiteien dennoch efüllt. Wuden Bia und tagevechiedene Labopäziion nicht mit Doppelbetimmungen an acht vechiedenen Tagen betimmt, o it da 95% β-toleanzintevall ebenfall gemäß Anhang II zu beechnen.

10 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 10 von 4.4 Stabilität (Stability), nach Ref. [0] Die chemiche Stabilität eine Analyten in eine gegebenen Matix unte betimmten Bedingungen fü gegebene Zeitintevalle. Die Stabilität eine Analyten ollte vom Zeitpunkt de Pobennahme bi zum Abchlu de Analye gewähleitet ein. Die Stabilität wähend de Lageung und wähend eventuell wiedeholtem Einfieen und Auftauen it methodenunabhängig, o da entpechende Stabilitätdaten au de Liteatu übenommen weden können. Sind olche nicht vohanden, ind ie im Rahmen de Methodenvalidieung zu eheben. Die Stabilität de (deivatiieten) Analyten in aufgeabeiteten Poben it hingegen in hohem Maße methodenabhängig und ihe Übepüfung im Rahmen de Validieung dahe zwingend efodelich..4.1 Stabilität aufgeabeitete Poben (Poceed ample tability) Die Stabilität de (deivatiieten) Analyten in fetig aufgeabeiteten Poben im Pobentelle de Autoampleample fü die Daue eine eguläen Analyeneie. Betimmung in de Paxi: - Aufabeitung von mindeten 6 QC-Poben bei niedigen und hohen Konzentationen elativ zum Kalibationbeeich - Poolen de aufgeabeiteten Poben de jeweiligen Konzentation - Aufteilung de gepoolten Poben de jeweiligen Konzentation auf mindeten 6 Aliquote - Injektion de Aliquote in egelmäßigen Intevallen übe einen Zeitaum, de de ewateten Daue eine eguläen Analyeneie in de Routine entpicht - Auftagen de aboluten (!) Peakflächen (ggf. Peakhöhen) fü die jeweilige Konzentation gegen die Zeitpunkte de Injektion mit anchließende lineae Regeionanalye Eine ignifikant negative Steigung de Regeiongeaden weit auf Intabilität de entpechenden (deivatiieten) Analyten in aufgeabeiteten Poben hin. Die maximal akzeptable Abnahme de Peakflächen (ggf. Peakhöhen) übe den Tetzeitaum betägt bei Vewendung deuteiete Standad 5% und in andeen Fällen 15% (0% nahe de Betimmunggenze).

11 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 11 von 4.4. Einfie-/Auftautabilität (Feeze/thaw tability) Die Stabilität de Analyten in de Pobenmatix bei wiedeholtem Einfieen und Auftauen. Betimmung in de Paxi: - Analye von jeweil 6 QC-Poben bei niedigen und hohen Konzentationen elativ zum Kalibationbeeich ohne voheige Behandlung (Kontollpoben) - Analye von jeweil 6 QC-Poben bei niedigen und hohen Konzentationen elativ zum Kalibationbeeich nach mindeten dei Einfie-/Auftauzyklen (Stabilitätpoben) - Jede Einfie-/Auftauzyklu oll au mindeten 0-tündigem Einfieen und mindeten eintündigem Auftauen betehen. De Mittelwet de Stabilitätpoben oll innehalb von % de entpechenden Kontollpobenmittelwete, da 90% Konfidenzintevall de Stabilitätpoben innehalb 80-10% de entpechenden Kontollpobenmittelwete liegen..4.3 Langzeittabilität (Long-tem tability) Die Stabilität de Analyten in de Pobenmatix wähend de Lageung übe längee Zeitäume. Betimmung in de Paxi: - Analye von jeweil 6 QC-Poben bei niedigen und hohen Konzentationen elativ zum Kalibationbeeich ohne voheige Behandlung (Kontollpoben, können identich ein mit Kontollpoben fü Einfie-/Auftautabilität) - Analye von jeweil 6 QC-Poben bei niedigen und hohen Konzentationen elativ zum Kalibationbeeich nach Lageung unte outineüblichen Lageungbedingungen möglicht übe outineübliche Lageungzeitäume (Stabilitätpoben) De Mittelwet de Stabilitätpoben oll innehalb von % de entpechenden Kontollpobenmittelwete, da 90% Konfidenzintevall de Stabilitätpoben innehalb 80-10% de entpechenden Kontollpobenmittelwete liegen.

12 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 1 von 4.5 Analytiche Genzen.5.1 Nachweigenze (Limit of Detection, LOD) Die Nachweigenze it definiet al die niedigte Konzentation de Analyten in de Pobe, bei de die Identifizieungkiteien efüllt ind. Zu Abchätzung können folgende Methoden vewendet weden: Betimmung übe Signal-Rauch-Vehältni: - Hetellung von Poben mit fallenden Analytkonzentationen im Beeich de ewateten Nachweigenze duch Auftocken von Leematix - Analye de Poben und Emittlung de Signal-Rauch-Vehältnie. Die Nachweigenze it hiebei die niedigte Konzentation de Analyten in de Pobenmatix, bei de da Signal-Rauch-Vehältni mindeten 3:1 betägt. Bei MS-Detektion gilt die owohl fü da Tagetion al auch fü die Qualifieionen Al zuätzliche Akzeptanzkiteium müen die Identifizieungkiteien (iehe allgemeine Richtlinie) auch an de Nachweigenze efüllt ein. Altenative fü MS-baiete Vefahen (Betimmung nach DIN 3645 [6]): - Hetellung von Kalibatoen bei mindeten fünf von Null vechiedenen Konzentationen beginnend im Beeich de ewateten Nachweigenze duch Auftocken von Leematix - Kalibatokonzentationen ollten möglicht gleichmäßig übe den Kalibationbeeich veteilt ein und die Konzentation de höchten Kalibato daf maximal da Zehnfache de eechneten Nachweigenze ein. Hinwei: De Beeich diee Kalibationkuve zu Betimmung de analytichen Genzen it damit in de Regel nicht identich mit dem vollen Kalibation- bzw. Lineaitätbeeich de Methode! - Analye de Kalibatoen mit eine Anzahl von Wiedeholbetimmungen po Konzentation, die de Anzahl de Wiedeholbetimmungen von Routinepoben entpicht (im Regelfall Einfachbetimmungen) - Auftagen de Peakflächenvehältnie, ggf. Peakhöhenvehältnie, (Analyt/IS) de chwächten Ion gegen die Sollkonzentationen de Kalibatoen - Lineae Regeion und Emittlung de Nachweigenze nach folgende Fomel mit α = 0,01 (bei GC-MS Betimmungen mit α = 0,1)

13 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 13 von 4 NG 1 m 1 n = x t 0 f, α + + Q x xo = Vefahentandadabweichung Q x = Summe de Abweichungquadate α = Signifikanzniveau (Fehle 1.At) n = Anzahl de Kalibationniveau t = Quantil de t-veteilung m =Anzahl de Meungen = Gehaltgöße.5. Betimmunggenze (Limit of Quantification, LOQ) Die Betimmunggenze it die niedigte Konzentation eine Analyten in de Pobenmatix, die mit akzeptablen Bia- (±0%) und Päziiondaten (RSD 0%) bzw. mit eine vogegebenen elativen Egebniunicheheit (33%, Signifikanz: 99%) betimmt weden kann. Betimmung in de Paxi: Altenative I (Betimmung nach DIN 3645 [6]) Die Vogehenweie entpicht de de Betimmung de Nachweigenze nach DIN Beide Paamete können im gleichen Expeiment emittelt weden. - Hetellung von Kalibatoen bei mindeten fünf von Null vechiedenen Konzentationen beginnend im Beeich de ewateten Nachweigenze duch Auftocken von Leematix - Kalibatokonzentationen ollten möglicht gleichmäßig übe den Kalibationbeeich veteilt ein und die Konzentation die Konzentation de höchten Kalibato daf maximal da Zehnfache de eechneten Nachweigenze ein. - Hinwei: De Beeich diee Kalibationkuve zu Betimmung de analytichen Genzen it damit in de Regel nicht identich mit dem vollen Kalibation- bzw. Lineaitätbeeich de Methode! - Analye de Kalibatoen mit eine Anzahl von Wiedeholbetimmungen po Konzentation, die de Anzahl de Wiedeholbetimmungen von Routinepoben entpicht (im Regelfall Einfachbetimmungen) - Auftagen de Peakflächenvehältnie, ggf. Peakhöhenvehältnie, (Analyt/IS) de Tagetion gegen die Sollkonzentationen de Kalibatoen - Lineae Regeion und Emittlung de Betimmunggenze nach folgende Fomel (k = 3 und mit α = 0,01)

14 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 14 von 4 BG = k x t f, α 0 1 m + 1 n + ( BG Q x ) xo= Vefahentandadabweichung Qx = Summe de Abweichung- k = elative Egebniunicheheit n = Anzahl de Kalibationniveau t = Quantil de t-veteilung α = Signifikanzniveau (Fehle 1.At) m =Anzahl de Meungen = Gehaltgöße β = Wahcheinlichkeit (Fehle.At) - Zuätzlich gilt, da die Betimmunggenze die Nachweigenze nicht untecheiten daf. It die beechnete Betimmungenze kleine al die Nachweigenze, o wid die Nachweigenze automatich auch die Betimmunggenze. Altenative II (Betimmung anhand von Bia- und Päziiondaten) nach Ref. [0] - Hetellung eine von den Kalibatoen unabhängigen QC-Pobe, deen Konzentation dee de niedigten Kalibato entpicht, duch Auftocken von Leematix - Wiedeholbetimmung (mindeten n = 5) de QC-Pobe - Betimmung de Bia und de Wiedeholpäziion al RSD de fünf Betimmungen - De Bia mu innehalb ±0% und die RSD 0% liegen.6 Wiedefindungate, Extaktionaubeute.6.1 Wiedefindungate (Recovey), fei nach [1] Die abolute Wiedefindung it definiet al komplette Tanfe de Analyten von de Matix in die zu vemeende Löung. Sie wid betimmt au einem Vehältni de Signale eine gleich zugeetzten Menge Analyt bzw. Standad zu eine biologichen Pobe und eine nicht extahieten Oiginallöung (= 100%). Die Betimmung de Wiedefindungate bezieht ich imme auf die aboluten Meignale. Sie kann dahe nu bei Methoden betimmt weden, bei denen die letztendlich vemeene Subtanz in eine Fom ehältlich it. Paktiche Duchfühung: Altenative I (Betimmung de Wiedefindung bei zwei Konzentationen) - Betimmung von jeweil mindeten ech Reinubtanzlöungen und mindeten ech Extakten bei hohen und niedigen Konzentationen - Angabe de Wiedefindung al Vehältni de aboluten Signale (Peakflächen, ggf. Peakhöhen) de Extakte zu denen de Reinubtanzlöungen in Pozent (inkl. Standadabweichung bzw. de 95%-Konfidenzintevall).

15 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 15 von 4 Altenative II (Betimmung de Wiedefindung übe den geamten Mebeeich) - Betimmung von Reinubtanzlöungen und Extakten bei mindeten ech übe den Mebeeich veteilten Konzentationen - Regeionanalye de aboluten Peakflächen (ggf. Peakhöhen) von Extakten und Reinubtanzlöungen übe den geamten Mebeeich - Angabe de Wiedefindung al Vehältni de Steigungen de Regeiongeaden de Extakte zu denen de Reinubtanzlöungen..6. Extaktionaubeute (Extaction efficieny) Die Extaktionaubeute it definiet al komplette Tanfe de Analyten von de Matix in den pimäen Extakt. Sie wid betimmt au einem Vehältni de Signale eine gleich zugeetzten Menge Analyt bzw. Standad zu eine biologichen Pobe und zu einem Pimäextakt eine Leematixpobe (= 100%). Die Betimmung de Extaktionaubeute it inbeondee bei olchen Methoden duchzufühen, die einen Deivatiieungchitt enthalten, da die letztendlich vemeenen Deivate in de Regel nicht al Reinubtanz ehältlich ind. Paktiche Duchfühung: Altenative I (Betimmung de Extaktionaubeute bei zwei Konzentationen) - Betimmung von jeweil mindeten ech Kontollpoben bei hohen und niedigen Konzentationen, bei denen de Analyt und de intene Standad et nach de Extaktion in den Pimäextakt gegeben weden (100%). - Betimmung von mindeten ech Extakten bei hohen und niedigen Konzentationen, bei denen de Analyt vo de Extaktion in die Matix, de intene Standad jedoch et nach de Extaktion in den Pimäextakt gegeben wid. - Angabe de Wiedefindung al Vehältni de Peakflächenvehältnie bzw. ggf. Peakhöhenvehältnie (Analyt/IS) de Extakte zu denen de Kontollpoben in Pozent (inkl. Standadabweichung bzw. de Konfidenzintevall (95%)). Altenative II (Betimmung de Extaktionaubeute übe den geamten Mebeeich) - Betimmung von mindeten ech übe den Mebeeich veteilten Kontollkalibatoen, bei denen de Analyt und de intene Standad et nach de Extaktion in den Pimäextakt gegeben weden (100%). - Betimmung von mindeten ech übe den Mebeeich veteilten Kalibatoen, bei denen de Analyt vo de Extaktion in die Matix, de intene Standad jedoch et nach de Extaktion in den Pimäextakt gegeben wid.

16 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 16 von 4 - Regeionanalye de Peakflächenvehältnie (ggf. Peakhöhenvehältnie) von Kontollkalibatoen und extahieten Kalibatoen - Angabe de Extaktionaubeute al Vehältni de Steigungen de Regeiongeaden de Kontollkalibatoen zu den extahieten Kalibatoen. Die Extaktion oll epoduzieba und mit hohen Wiedefindungaten bzw. Extaktionaubeuten, möglicht göße al 50% efolgen, entpechend eine Steigung von 0,5 beim Regeionvefahen..7 Matixeffekte und Wiedefindung bei LC-MS(/MS)-Methoden Unte Matixeffekten veteht man die diekte ode indiekte Veändeung de Meignal duch die Anweenheit unbeabichtigte Analyten (zu Analye) ode andee intefeieende Subtanzen in de Pobe. Dabei ind owohl eine Untedückung (Ion uppeion) al auch eine Vetäkung (Ion enhancement) de Meignal möglich. Paktiche Duchfühung: - Betimmung von jeweil mindeten fünf Reinubtanzlöungen bei hohen und niedigen Konzentationen (Kontollen) - Hetellung und Extaktion von jeweil fünf aufgetockten Matixpoben bei hohen und niedigen Konzentationen, wobei fü jede de fünf Poben eine andee Leematixquelle zu vewenden it (aufgetockte Matixpoben) - Hetellung von jeweil fünf aufgetockten Leematixextakten bei hohen und niedigen Konzentationen, wobei die Extakte au den oben genannten untechiedlichen Matixpoben tammen müen (aufgetockte Extakte) - Analye de Kontollpoben, aufgetockten Matixpoben und aufgetockten Extakte mittel LC-MS(/MS) - Angabe de Wiedefindung al Vehältni de Peakflächen (ggf. Peakhöhen) de aufgetockten Matixpoben zu denen de entpechenden aufgetockten Extakte in Pozent (Mittelwet inkl. Standadabweichung) - Angabe de Matixeffekte al Vehältni de Peakflächen (ggf. Peakhöhen) de aufgetockten Extakte zu denen de Kontollpoben (Mittelwet inkl. Standadabweichung) in Pozent Fü die Wiedefindung ind die unte Kapitel.6 angegebenen Akzeptanzgenzen anzuwenden. Fü den Mittelwet de Matixeffekte gilt ein Akzeptanzintevall von 75-15%. Bei de Standadabweichung de Matixeffekte gelten bei Vewendung deuteiete intene Standad 5%, anonten 15% (0% nahe de Betimmunggenze) al akzeptabel.

17 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 17 von 4.8 Robutheit (Robutne, Ruggedne), fei nach Ref. [0] Die Robutheit eine analytichen Methode it ein Maß ihe Fähigkeit, duch kleine, abe bewute Veändeungen de Methodenpaamete unbeeinflut zu bleiben, und zeigt ihe Velälichkeit wähend de nomalen Anwendung. 3 Immunchemiche Methoden Die volle Validieung immunchemiche Methoden it aufgund de vefahenbedingten Nichtlineaität de Kalibationkuven, de entcheidenden Einflue de Velauf diee Kalibationkuven auf die Zuveläigkeit de poitiv-negativ Entcheidung am Cut-off-Wet, owie de Anfälligkeit gegenübe unewünchten Keuzeaktivitäten und unpezifiche Bindung an Matixkomponenten eh komplex. Sie wid dahe in de Regel vom Hetellen fü die von ihm pezifizieten Matice und Cut-off-Wete validiet, o da bei eine Anwendung im Rahmen diee Spezifikationen auf eine weitee Validieung duch den Anwende vezichtet weden kann. Weden die immunchemichen Vefahen jedoch abweichend von den Vogaben de Hetelle vewendet, z.b. fü andee Matice und/ode mit andeen al den vom Hetelle vogechlagenen Cut-off-Weten, ode exitieen Genzwetvogaben fü die Betätigunganalyen, ind zumindet die untentehenden Validieungexpeimente duchzufühen. Bei goßen Abweichungen von den Hetelleempfehlungen kann auch eine umfaende Validieung efodelich weden, die dann nach den Vogaben de US Food and Dug Adminitation (FDA) [] vogenommen weden ollte. 3.1 Selektivität Betimmung in de Paxi: - Betimmung von mindeten 10 Leepoben au jeweil vechiedenen Chagen mit dem entpechenden immunchemichen Vefahen (ggf. nach Pobenvobeeitung wie z.b. enzymatiche Hydolye, Poteinfällung, Extaktion etc.) Bei dieen Leepoben ollte möglicht kein poitive Egebni voliegen. 3. Aueichende Empfindlichkeit Da immunchemiche Methoden al Votete zu Identifizieung potentiell poitive Poben vewendet weden, mu ichegetellt weden, da bei elevanten Konzentationen de elevanten Zielanalyten de Pobe ein poitive Egebni ehalten wid.

18 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 18 von 4 Betimmung in de Paxi: - Auwahl von mindeten 10 authentichen Poben, fü die im Betätigungvefahen eine Konzentation de Zielanalyten im Beeich de efodelichen Betimmunggenze de Betätigungvefahen betimmt wude - Analye de oben genannten Poben mit dem immunchemichen Vefahen (ggf. nach Pobenvobeeitung wie z.b. enzymatiche Hydolye, Poteinfällung, Extaktion etc.) - bei Guppentet epaate Unteuchung fü die elevanten Zielanalyten de Guppe In mindeten 90% de Fälle mu ein poitive immunchemiche Egebni voliegen.

19 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 19 von 4 4 Liteatu [1] Pete FT, Dumme OH, Muhoff F (007) Validation of new method. Fo.Sci.Int. 165:16-4. [] Beolle F, Bomet PM, Audan M (1996) Validation of liquid chomatogaphic and ga chomatogaphic method. Application to phamacokinetic. J.Chomatog.B 686:3-10 [3] Cauon R (1997) Validation of chomatogaphic method in biomedical analyi. Viewpoint and dicuion. J.Chomatog.B 689: [4] Dadga D, Bunett PE (1995) Iue in evaluation of bioanalytical method electivity and dug tability. J.Pham.Biomed.Anal. 14:3-31 [5] Dadga D, Bunett PE, Choc MG, Gallicano K, Hoope JW (1995) Application iue in bioanalytical method validation, ample analyi and data epoting. J.Pham.Biomed.Anal. 13:89-97 [6] EURACHEM / CITAC. Quantifying Uncetainty in Ananlytical Meauement [7] Hatmann C, Maat DL, McDowall RD (1994) An analyi of the Wahington Confeence Repot on bioanalytical method validation. J.Pham.Biomed.Anal. 1: [8] Hatmann C, Smeye-Vebeke J, Maat DL, McDowall RD (1998) Validation of bioanalytical chomatogaphic method. J.Pham.Biomed.Anal. 17: [9] Intenational Confeence on Hamonization (ICH). Validation of Analytical Method: Definition and Teminology. ICH Q A [10] Intenational Confeence on Hamonization (ICH). Validation of Analytical Method: Methodology. ICH Q B [11] Intenational Oganization fo Standadization (ISO). Accuacy (Tuene and Peciion) of Meauement Method and Reult. ISO/DIS to [1] Kane HT, Shiu G, Shah VP (1991) Validation of bioanalytical method. Pham.Re. 8:41-46 [13] Komida S (000) Validieung in de Analytik. Wiley-VCH, Weinheim [14] Lindne W, Waine IW (1998) Requiement fo initial aay validation and publication in J. Chomatogaphy B [editoial]. J.Chomatog.B 707:1- [15] NCCLS (1999) Evaluation of Peciion Pefomance of Chlinical Chemity Device; Appoved Guideline. NCCLS, Wayne, PA [16] Penninckx W, Hatmann C, Maat DL, Smeye-Vebeke J (1996) Validation of the Calibation Pocedue in Atomic Aboption Spectometic Method. J.Anal.At.Spectom. 11:37-46 [17] Pete FT, Maue HH (001) Bioanalytical method validation How, how much and why? A eview. Toxichem.Kimtech. 68: ( [18] Pete FT, Maue HH (00a) Bioanalytical method validation How, how much and why? A eview. TIAFT Bulletin 3:16-3 [19] Pete FT, Maue HH (00b) Bioanalytical method validation and it implication fo foenic and clinical toxicology - A eview. Acced.Qual.Au. 7: [0] Shah VP, Midha KK, Dighe S, McGilveay IJ, Skelly JP, Yacobi A, Layloff T, Viwanathan CT, Cook CE, McDowall RD, Pittman KA, Specto S (199) Analytical method validation: bioavailability, bioequivalence and phamacokinetic tudie. Confeence epot. Pham.Re. 9: [1] Shah VP, Midha KK, Findlay JW, Hill HM, Hule JD, McGilveay IJ, McKay G, Mille KJ, Patnaik RN, Powell ML, Tonelli A, Viwanathan CT, Yacobi A (000) Bioanalytical method validation--a eviit with a decade of poge. Pham.Re. 17: [] U.S.Depatment of Health and Human Sevice, Food and Dug Adminitation. Guidance fo Induty, Bioanalytical Method Validation [3] Vande-Heyden Y., Nijhui A, Smeye-Vebeke J, Vandeginte BG, Maat DL (001) Guidance fo obutne/uggedne tet in method validation. J Pham Biomed Anal 4:73-753

20 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 0 von 4 [4] Wieling J, Hendik G, Tamminga WJ, Hempeniu J, Menink CK, Ootehui B, Jonkman JH (1996) Rational expeimental deign fo bioanalytical method validation. Illutation uing an aay method fo total captopil in plama. J.Chomatog.A 730: [5] Hubet Ph, Nguyen-Huu J-J, Boulange B, Chapuzet E, Cohen N, Compagnon P-A, Dewe W, Feinbeg M, Lauentie M, Mecie N, Muzad G, Valat L, Rozet E (007) Hamonization of tategie fo the validation of quantitative analytical pocedue, A SFSTP Popoal - Pat III. J.Pham.Biomed.Anal. 45:8-96 [6] DIN EN ISO/IEC 3645: Inkaftteten Diee Anlage wude gemäß Bechlu de Votande de GTFCh vom veabchiedet und titt mit de Publikation im Toxichem + Kimtech in Kaft. E gelten Übegangfiten bi

21 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 1 von 4 Anhang I: Beechnung de Päziiondaten Beide unten aufgefühten Beechnungvefahen entpechen im Pinzip de ISO 575- (Baic method fo the detemination of epeatability and epoducibility of a tandad meauement method). Alleding wid in diee Nom tatt de Repoduziebakeit (epoducibility) die tagevechiedene Labopäziion beechnet. Die aufgefühten Fomeln ind teilweie veeinfacht und gelten dahe nu fü Veuchdeign, bei denen an meheen Tagen jeweil gleich viele Betimmungen unte Wiedeholbedingungen duchgefüht weden. It diee Gundvoauetzung nicht gegeben, müen die komplexeen, allgemeingültigen Fomeln au de ISO 575- vewendet weden. A. Beechnung au Paameten de eineitigen Vaianzanalye (one-way ANOVA, in gängigen Statitikpogammen, z.b. SPSS, enthalten) Bei dieem Vefahen weden die Mewete zunächt eine eineitigen Vaianzanalye (one-way ANOVA) untewofen. Dabei ehält man in de ANOVA-Tabelle die mittleen Abweichungquadate innehalb de Guppen (hie Tage) und zwichen den Guppen. Au dieen Paameten laen ich dann Wiedeholpäziion und Labopäziion duch einfache mathematiche Opeationen betimmen. 1. Wiedeholpäziion Beechnung de Wiedeholvaianz = MS wg Wiedeholvaianz MS wg Mittlee Abweichungquadat innehalb de Guppen (Tage) Beechnung de Wiedeholpäziion au de Wiedeholvaianz RSD RSD MS wg [%] = 100 = 100 Wiedeholpäziion Wiedeholvaianz Mittelwet alle Betimmungen MS wg Mittlee Abweichungquadat innehalb de Guppen (Tagen)

22 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite von 4. Tagevechiedene Labopäziion Beechnung de Vaianz zwichen den Tagen t MS = bg MS n wg t Vaianz zwichen den Tagen MS bg Mittlee Abweichungquadat zwichen den Guppen (Tagen) MS wg Mittlee Abweichungquadat innehalb de Guppen (Tagen) n Anzahl de Wiedeholbetimmungen po Tag (fü da vogechlagene Deign gilt n = ) Anmekung: Fall ich bei de Beechnung zufallbedingt ein negative Egebni fü egibt, o it anzunehmen, da diee den Wet Null hat. t Beechnung de tagevechiedenen Labopäziion RSD (T) + t [%] = 100 R SD (T) tagevechiedene Labopäziion t Vaianz zwichen den Tagen Wiedeholvaianz Mittelwet alle Betimmungen B. Diekte Beechnung au den Meweten Bei dieem Vefahen weden die Wiedeholpäziion und die Labopäziion diekt au den Meweten betimmt. Die entpechenden Fomeln ind zwa eheblich komplexe, mit Pogammen wie MS Excel ode Valitat ( jedoch duchau zu bewältigen. 1. Wiedeholpäziion Beechnung de Wiedeholvaianz = p i= 1 n ( xik xi ) k= 1 p (n 1) Wiedeholvaianz p Anzahl de Tage (fü da vogechlagene Deign gilt p = 8) n Anzahl de Wiedeholbetimmungen po Tag (fü da vogechlagene Deign gilt n = ) x ik k-te Betimmung am i-ten Tag x i Mittelwet de Betimmungen am i-ten Tag

23 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 3 von 4 Beechnung de Wiedeholpäziion au de Wiedeholvaianz RSD [%] = 100 = p i= 1 n ( xik xi ) k= 1 p (n 1) 100 RSD Wiedeholpäziion Wiedeholvaianz Mittelwet alle Betimmungen p Anzahl de Tage (fü da vogechlagene Deign gilt p = 8) n Anzahl de Wiedeholbetimmungen po Tag (fü da vogechlagene Deign gilt n = ) x ik k-te Betimmung am i-ten Tag x i Mittelwet de n Betimmungen am i-ten Tag. Tagevechiedene Labopäziion Beechnung de Vaianz zwichen den Tagen t = p i= 1 (x ) i p 1 n t x i Vaianz zwichen den Tagen Mittelwet de n Betimmungen am i-ten Tag Mittelwet alle Betimmungen p Anzahl de Tage (fü da vogechlagene Deign gilt p = 8) Wiedeholvaianz n Anzahl de Wiedeholbetimmungen po Tag (fü da vogechlagene Deign gilt n = ) Anmekung: Fall ich bei de Beechnung zufallbedingt ein negative Egebni fü egibt, o it anzunehmen, da diee den Wet Null hat. t Beechnung de tagevechiedenen Labopäziion RSD (T) + t [%] = 100 R SD (T) tagevechiedene Labopäziion t Vaianz zwichen den Tagen Wiedeholvaianz Mittelwet alle Betimmungen

24 GTFCh: Anhang B zu Richtlinie zu Qualitäticheung (Validieung), Veion 01 Seite 4 von 4 Anhang II: Beechnung de 95% β-toleanzintevall gemäß [5] Da ogenannte β-toleanzintevall entpicht dem Intevall, in dem auf de Bai de emittelten Bia und Päziiondaten 95% de künftigen Kontollmeungen de entpechenden Konzentationniveau zu ewaten ind. Liegt diee Toleanzintevall volltändig innehalb de oben genannten Akzeptanzintevall, ind omit mindeten 95% de künftigen Kontollmeungen de entpechenden Konzentationniveau innehalb de Akzeptanzintevall zu ewaten. Da 95% β-toleanzintevall kann mittel folgende Fomeln beechnet weden. Voauetzung it alleding, da die Anzahl de Wiedeholbetimmungen fü alle Tage gleich it. L L u o 1 p n B [%] = Bia[ %] t 1 + RSD [%] f;0,975 [%] = Bia[ %] + t 1 + RSD [%] f;0,975 1 p n B (T) (T) (R + 1) (R + (1/ n)) /(p 1) + (1 (1/ n)) / pn f = t R = B = R + 1 n R + 1 L u L o f t f;0,975 untee Genze de 95% β-toleanzintevall obee Genze de 95% β-toleanzintevall Anzahl de Feiheitgade 97.5%-Pezentil de t-veteilung bei f Feiheitgaden R SD (T) tagevechiedene Labopäziion p n t Anzahl de Tage Anzahl de Wiedeholbetimmungen po Tag Wiedeholvaianz Vaianz zwichen den Tagen